IVERMECTINA

February 14, 2025

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Indicazioni basate sull’evidenza per l’ivermectina nelle malattie parassitarie: un approccio integrato al contesto e alle sfide in Perù

Astratto

L’ivermectina è emersa come opzione terapeutica per varie malattie parassitarie, tra cui strongiloidiasi, scabbia, infestazioni da pidocchi, gnatostomiasi e miasi. Questo studio esamina in modo completo le indicazioni basate sull’evidenza per l’ivermectina nel trattamento delle malattie parassitarie, considerando il contesto e le sfide uniche in Perù.

Quattordici studi sono stati selezionati da una ricerca sistematica di prove scientifiche sull’ivermectina in PubMed, dal 2010 a luglio 2022. Il dosaggio ottimale di ivermectina per il trattamento di oncocercosi, strongiloidiasi ed enterobiosi varia da 150 a 200 μg/kg, mentre la filariosi linfatica richiede una dose più elevata di 400 μg/kg (Brown et al., 2000).

Tuttavia, i dosaggi aumentati sono stati associati a una maggiore incidenza di eventi avversi oculari. Le prove scientifiche dimostrano che l’ivermectina può essere somministrata in modo sicuro ed efficace ai bambini di peso inferiore a 15 kg.

Revisioni sistematiche e meta-analisi forniscono un forte supporto all’efficacia e alla sicurezza dell’ivermectina nella lotta alle infezioni parassitarie. L’ivermectina ha dimostrato di essere un trattamento efficace per varie malattie parassitarie, tra cui parassiti intestinali, ectoparassiti, filariosi e oncocercosi. I dosaggi che vanno da 200 μg/kg a 400 μg/kg sono generalmente sicuri, con aggiustamenti effettuati in base alla patologia specifica, all’età del paziente e al peso/altezza.

Date le condizioni sociali e ambientali prevalenti in Perù, l’elevato carico di parassiti intestinali ed ectoparassiti nel paese sottolinea l’importanza dell’ivermectina nell’affrontare queste sfide per la salute.

1. Introduzione

Alla ricerca di nuovi agenti antiparassitari, è stato scoperto un nuovo composto chiamato avermectina. Da questo composto, l’ivermectina, una molecola semisintetica, è stata derivata e inizialmente introdotta come prodotto commerciale per scopi di salute animale. ( González Canga et al., 2008 ). Negli esseri umani, la prima specialità contenente ivermectina è stata Mectizan, che ha una lunga storia di utilizzo in campo medico ( González Canga et al., 2008 ).

Nel corso degli anni, sono stati condotti e pubblicati numerosi studi che hanno indagato l’efficacia e la sicurezza di Mectizan nel trattamento di varie malattie parassitarie. Questi studi hanno contribuito a stabilire Mectizan come pietra angolare nella gestione delle infezioni parassitarie, evidenziando il suo ruolo nel migliorare i risultati di salute pubblica. L’ampio corpus di ricerche su Mectizan non ha solo informato la pratica clinica, ma ha anche contribuito alla nostra comprensione delle potenziali applicazioni dell’ivermectina, aprendo la strada al suo uso esteso nel trattamento di altre malattie parassitarie.

L’ivermectina è un metabolita secondario prodotto dal batterio Streptomyces avermitilis , che appartiene al gruppo degli actinomiceti che vivono nel suolo. In questo contesto, un metabolita secondario è un composto che non è essenziale per la crescita di base, lo sviluppo o la riproduzione dell’organismo, ma svolge altre funzioni importanti, come la difesa dai predatori o l’inibizione della crescita di organismi concorrenti. Streptomyces avermitilis è un tipo di actinomicete che vive nel suolo, che sono batteri filamentosi noti per la loro capacità di produrre un’ampia varietà di composti biologicamente attivi, tra cui antibiotici e altri prodotti farmaceutici.

Questo composto presenta proprietà lipofile, ovvero ha un’affinità per gli ambienti ricchi di lipidi. Di conseguenza, gli individui con un indice di massa corporea (BMI) più elevato possono sperimentare concentrazioni plasmatiche inferiori del composto a causa della sua maggiore distribuzione nei tessuti adiposi. Ciò può portare a un’emivita più lunga ( Schulz et al., 2019 ), che è il tempo necessario affinché la concentrazione della sostanza nel corpo diminuisca della metà.

Di conseguenza, è essenziale prescrivere la dose di questo composto in base al peso corporeo del paziente, utilizzando un’unità specifica come microgrammi per chilogrammo (μg/kg) ( Duthaler et al., 2019 ), al fine di garantirne l’efficacia terapeutica e ridurre al minimo i potenziali effetti collaterali.

L’ivermectina ha dimostrato la sua efficacia nel combattere un ampio spettro di infezioni parassitarie. Come agente antiparassitario, colpisce una vasta gamma di parassiti, compresi quelli responsabili di malattie come l’oncocercosi (cecità fluviale), la strongiloidiasi, la filariosi linfatica e la scabbia. Il farmaco agisce interrompendo il normale funzionamento del sistema nervoso della parassita, portando infine alla paralisi e alla morte. Ciò consente al sistema immunitario dell’ospite di eliminare efficacemente gli invasori. L’ampia efficacia dell’ivermectina contro vari parassiti rende uno strumento prezioso nel trattamento e nel controllo di molteplici malattie parassitarie, apportando significativi miglioramenti nella salute pubblica globale.

Negli elminti (vermi parassiti), l’ivermectina agisce prendendo di mira i canali del cloruro sensibili al neurotrasmettitore glutammato ( Fox, 2006 ). Aprendo questi canali, il farmaco interrompe il normale funzionamento del sistema nervoso centrale del parassita, portando alla paralisi e alla morte. Un esempio notevole dell’efficacia dell’ivermectina è la sua azione contro l’oncocercosi umana, una malattia causata dal verme parassita Onchocerca volvulus. L’oncocercosi, nota anche come cecità fluviale, è una malattia trasmessa da vettori attraverso le punture di specie infette di Simulium, comunemente note come mosche nere ( Aziz et al., 1982 ). Incapacitando i vermi adulti e impedendo il rilascio di microfilarie (larve immature), l’ivermectina aiuta a controllare la diffusione e l’impatto di questa malattia debilitante.

L’ivermectina è efficace anche contro alcuni protozoi che, insieme agli elminti, sono prevalenti nei bambini e rappresentano un problema significativo per la salute pubblica, in particolare nei paesi in via di sviluppo ( Vasquez-Elera et al., 2022 ). I protozoi sono microrganismi unicellulari che possono causare varie malattie negli esseri umani. Sia le infezioni da protozoi che da elminti possono portare a gravi problemi di salute, soprattutto nei bambini, che possono soffrire di crescita compromessa, sviluppo cognitivo e funzione immunitaria di conseguenza. Prendendo di mira questi parassiti, l’ivermectina svolge un ruolo cruciale nell’affrontare queste sfide per la salute e migliorare il benessere generale delle popolazioni colpite, soprattutto in contesti con risorse limitate in cui l’accesso all’assistenza sanitaria può essere limitato.

In America Latina, si stima che oltre 40 milioni di bambini siano esposti a un tipo di parassita intestinale, che è uno dei principali problemi di salute pubblica che colpisce oltre il 30% della popolazione mondiale. La prevalenza e l’intensità delle malattie parassitarie sono associate a un rischio più elevato di malattia e sono spesso molto elevate, soprattutto nelle popolazioni in età scolare, il che porta a problemi per quanto riguarda le prestazioni fisiche e mentali e la salute ( Geletaw et al., 2021 ).

Negli ultimi tempi, l’uso dell’ivermectina si è espanso a livello globale, principalmente a causa di numerose fonti di informazione che ne promuovevano il potenziale come trattamento per SARS-CoV-2, il virus responsabile del COVID-19 ( Castañeda-Marín et al., 2020 ). Con lo sviluppo della pandemia, ricercatori e professionisti sanitari hanno cercato di identificare farmaci esistenti che potessero essere riutilizzati per combattere il virus. L’ivermectina, con le sue note proprietà antiparassitarie e antinfiammatorie, è emersa come candidata per ulteriori indagini. Di conseguenza, la diffusione diffusa di queste informazioni, attraverso vari canali come articoli scientifici, notiziari e social media, ha contribuito all’aumento dell’interesse globale e all’utilizzo dell’ivermectina come potenziale opzione di trattamento per il COVID-19.

In Perù, l’ivermectina è stata somministrata a circa il 90% dei pazienti ospedalizzati affetti da infezioni da SARS-CoV-2 ( Vasquez-Elera et al., 2022 ). Durante la pandemia di COVID-19, gli operatori sanitari hanno cercato potenziali opzioni di trattamento per alleviare il peso sui pazienti e sui sistemi sanitari. L’ivermectina, con le sue note proprietà antiparassitarie e il potenziale suggerito contro SARS-CoV-2, è diventata un’opzione di trattamento ampiamente utilizzata in Perù. Questa diffusa adozione può essere attribuita all’urgente necessità di terapie efficaci e al desiderio di esplorare farmaci disponibili che potrebbero potenzialmente migliorare i risultati dei pazienti durante la pandemia.

A causa del recente interesse per l’uso dell’ivermectina per il trattamento e la prevenzione del COVID-19, abbiamo condotto una revisione completa della letteratura scientifica sull’uso dell’ivermectina come agente antiparassitario in tutto il mondo. L’obiettivo di questo studio è condurre una revisione completa della letteratura sull’uso dell’ivermectina nel trattamento delle infezioni parassitarie, inclusa la sua efficacia e sicurezza, con un’attenzione specifica alla prevalenza delle infezioni parassitarie in Perù e al potenziale per l’uso dell’ivermectina nelle campagne di trattamento di massa.

2. Frequenza delle malattie parassitarie in Perù

In Perù, le infezioni parassitarie sono un problema di salute pubblica significativo, in particolare nelle aree rurali ed economicamente svantaggiate ( Chosidow et al., 2010 ). La prevalenza di queste infezioni può variare notevolmente a seconda di fattori quali regione, età, stato socioeconomico e accesso ad acqua pulita e strutture igienico-sanitarie.

In Perù, la distribuzione delle malattie parassitarie è stata documentata nelle popolazioni trattate tra il 2010 e il 2017 ( Vidal-Anzardo et al., 2020 ). A livello nazionale, la prevalenza delle malattie parassitarie complessive e delle infezioni da elminti era rispettivamente del 4,9% e del 3,3%. Inoltre, il 5,3% dei bambini di età compresa tra 12 e 17 anni è stato trovato affetto da un’infezione parassitaria. Le regioni più colpite includevano le aree nord-orientali con climi tropicali e le regioni andine elevate ( Vidal-Anzardo et al., 2020 ) ( Fig. 1 ). Queste regioni sono note per il loro basso status socioeconomico in Perù ( León Mendoza, 2019 ). Inoltre, la prevalenza delle malattie parassitarie variava a seconda delle fasce d’età: 9,5% tra i bambini di età compresa tra 0 e 11 anni, 5,3% tra gli adolescenti di età compresa tra 12 e 17 anni, 2,2% tra i giovani adulti di età compresa tra 18 e 29 anni e frequenze più basse tra le altre fasce d’età.

2. Frequenza delle malattie parassitarie in Perù

3. Sicurezza dell’ivermectina

La sicurezza dell’ivermectina è stata valutata in diversi studi scientifici ed è stato scoperto che la dose efficace di ivermectina per il trattamento di oncocercosi, strongiloidosi ed enterobiosi è compresa tra 150 e 200 μg/kg ( Juarez et al., 2018 ). Per altre malattie come la filariosi linfatica la dose utilizzata è di 400 μg/kg.

Dosi superiori a 400 μg/kg sono ancora efficaci, ma aumentano il numero di casi di eventi avversi oculari, soprattutto nei pazienti con oncocercosi ( Aziz et al., 1982 ). Si afferma che l’ivermectina genera bassi livelli di tossicità perché il suo effetto non raggiunge il sistema nervoso centrale e la tossicità dipende dalle risposte immunitarie e infiammatorie contro i parassiti, come febbre, prurito, eruzioni cutanee e malessere ( Chandler, 2018 ).

Nei bambini di età inferiore ai due anni con meno di 15 kg, è stato suggerito di non utilizzare l’ivermectina; tuttavia, esistono solide prove scientifiche che l’uso dell’ivermectina può essere sicuro ed efficace nei bambini con meno di 15 kg. A questo proposito, una revisione sistematica ha analizzato l’efficacia e la sicurezza dell’ivermectina nei bambini di peso inferiore a 15 kg, in cui è stato riscontrato che l’ivermectina è stata utilizzata in 1088 bambini di peso inferiore a 15 kg. L’indicazione medica per questa fascia di età era di utilizzare questo agente antiparassitario per il trattamento di infezioni dovute a strongiloidosi, scabbia, infestazioni da pidocchi, gnatostomiasi, miasi e per la riduzione degli elminti trasmessi attraverso il suolo, per i quali questo farmaco è stato utile per il controllo delle malattie sopra menzionate ( Jittamala et al., 2021 ). Nello studio viene menzionata la presenza di 18 possibili eventi avversi; i più frequenti sono stati quattro (4/1088) dovuti a diarrea (0,4%).

L’ivermectina sembra promettente come opzione di trattamento per le donne incinte, poiché gli studi hanno dimostrato che può ridurre efficacemente i tassi di anemia e infezioni parassitarie in questa popolazione. Inoltre, ha avuto buoni risultati perinatali nei neonati. Tuttavia, non è ancora stata approvata a livello globale e sono ancora in corso studi clinici ( Nicolas et al., 2020 ).

4. Indicazioni dell’ivermectina

Lo scopo della ricerca descritto in questa sezione era raccogliere prove scientifiche sulle indicazioni e gli usi dell’ivermectina, escludendo la sua potenziale applicazione per le infezioni correlate a COVID-19 o SARS. La ricerca è stata condotta utilizzando il database PubMed, che include studi da vari paesi in tutto il mondo.

I termini di ricerca “Mesh” e “Tiab” sono stati utilizzati in combinazione con parole chiave specifiche correlate all’ivermectina (come “Ivermectina”, “Mectizan”, “Stromectol”, “Eqvalan” e “Ivomec”) ed escludendo i termini correlati a COVID-19 o SARS (come “Covid*” e “sars*”). Per affinare i risultati della ricerca, sono stati applicati filtri per “soggetto: umano” e “anno: 2010-2022” (fino a luglio 2022).

Oltre alla ricerca su PubMed, abbiamo anche esaminato le linee guida per la pratica clinica e le sintesi delle principali istituzioni per raccogliere ulteriori prove sulle indicazioni dell’ivermectina.

Dei 1697 studi identificativi nella ricerca, 14 sono stati selezionati per il loro elevato livello di evidenza scientifica (incluse revisioni sistematiche, sperimentazioni cliniche e studi osservazionali) e buona qualità metodologica. Questi studi hanno utilizzato l’ivermectina per varie indicazioni, come dettagliato nella Tabella 1 .

Tabella 1.

Riepilogo delle prove sulle indicazioni dell’ivermectina nel trattamento delle infezioni parassitarie.

Indicazione	Commenti	Prova
Filariosi linfatica	Una singola dose orale di IVM a 200 μg/kg ( Kimberlin, 2015 ). IVM riduce il 60% delle microfilarie il primo giorno e l’85% il 30° giorno ( Pion et al., 2019 ).	Revisioni sistematiche con meta-analisi: Pion et al., 2019 Siewe Fodjo et al., 2020
Oncocercosi	Una singola dose orale di IVM a 150 μg/kg, che può essere ripetuta ogni sei o dodici mesi fino a quando non si è asintomatici. Per la prevenzione della cecità dovuta all’oncocercosi oculare, il dosaggio deve essere ripetuto ogni tre o dodici mesi ( Kimberlin, 2015 ).	Revisioni sistematiche con meta-analisi: Siewe Fodjo et al., 2020
Elmintiasi trasmesse dal suolo (anchilostomiasi-ascaridiasi, tricuriasi) e teniasi nel duodeno, tenia solium, ecc.)	Una singola dose di IVM a 200 μg/kg per due giorni è efficace ( Kimberlin, 2015 ). L’IVM combinato con l’albendazolo è in grado di dimezzare gli elminti rispetto all’albendazolo da solo. (RR: 0,44; 95% IC: 0,31 a 0,62) ( Palmeirim et al., 2018 )	Revisioni sistematiche con meta-analisi: Palmeirim et al., 2018
Ectoparassiti (infestazioni da pidocchi, scabbia, acari, pulci, ecc.).	Dose orale di 400 μg/kg il primo e l’ottavo giorno, oppure 200 μg/kg, da ripetere dopo 10 giorni ( Kimberlin, 2015 ). L’assunzione orale di IVM ha un’efficacia maggiore rispetto all’IVM topico per il trattamento della scabbia ( Rosumeck et al., 2018 ).	Revisioni sistematiche con meta-analisi: Rosumeck et al., 2018
Strongiloidiasi	Dose orale di 200 μg/kg due volte al giorno per due giorni. Nel trattamento delle malattie parassitarie, l’IVM si è dimostrato più efficace dell’albendazolo (RR 1,79; IC 95%: 1,55 a 2,08), ma simile al tiabendazolo (RR 0,80; IC 95%: 0,59 a 1,09); tuttavia, gli eventi avversi sono stati inferiori utilizzando l’IVM ( Henriquez-Camacho et al., 2016 ).	Revisioni sistematiche con meta-analisi: Henriquez-Camacho et al., 2016
Miasi	Somministrazione orale con una dose singola di 250 μg/kg	Studi osservazionali: Calvopina et al., 2020
Larva migrante	Somministrazione orale di una dose singola giornaliera di 200 μg/kg per due giorni	Studi osservazionali: Gerbig e Kempf, 2020
Pediculus umanoide capitis	Dose orale di 400 μg/kg il primo e l’ottavo giorno, oppure 200 μg/kg con dose ripetuta dopo 10 giorni	Systematic review with meta-analysis: Jones and English 3rd., 2003 Randomized clinical trial: Chosidow et al., 2010
Rosacea (due to mite infestations, Demodex folliculorum)	Topical 1% IVM demonstrated that ivermectin can control papulopustular rosacea and improve life quality.	Systematic review and meta-analysis: Husein-ElAhmed and Steinhoff, 2020
Malaria	There exists evidence of reduction in malaria indexes and sporozoites by 77% when mass IVM is used (Alout et al., 2014).	Epidemiological study: Alout et al., 2014

5. Somministrazione di massa del farmaco Ivermectina

L’implementazione della somministrazione massiva di ivermectina si è dimostrata efficace in vari paesi per il controllo e l’eliminazione di parassiti specifici, come supportato da prove scientifiche. In questa sezione dello studio, abbiamo compilato e documentato le applicazioni dell’ivermectina come descritto nella letteratura scientifica ( Tabella 2 ).

Tabella 2.

Utilizzo di massa dell’ivermectina e sua efficacia contro le malattie parassitarie.

Malattia	Popolazione	% basale di malattie parassitarie	% di malattie parassitarie dopo un mese	% di malattie parassitarie dopo nove-dodici mesi
Ancylostomiasi ( Necator americanus e Ancylostoma duodenale)	Brasile nord-orientale, età media 26,4, 48,4% erano maschi. Un totale di 516 persone ( Heukelbach et al., 2004 ) ( Heukelbach et al., 2004 )	28.5	16.4	7.7

Ascaridiosi	Brasile nord-orientale, età media 26,4, 48,4% erano maschi. Un totale di 516 persone ( Heukelbach et al., 2004 ) ( Heukelbach et al., 2004 )	17.1	0,4	0,4
Tricuriasi	Brasile nord-orientale, età media 26,4, 48,4% erano maschi. Un totale di 516 persone ( Heukelbach et al., 2004 ) ( Heukelbach et al., 2004 )	16.5	3.4	9.4

Strongiloidiasi	Brasile nord-orientale, età media 26,4, 48,4% erano maschi. Un totale di 516 persone ( Heukelbach et al., 2004 ) ( Heukelbach et al., 2004 )	11.0	0,6	0,7
Infestazione da pidocchi (Brasile)	Brasile nord-orientale, età media 26,4, 48,4% erano maschi. Un totale di 548 persone ( Heukelbach et al., 2004 ) ( Heukelbach et al., 2004 )	28.1	21.1	13.5
Scabbia (Brasile)	Brasile nord-orientale, età media 26,4, 48,4% erano maschi. Un totale di 548 persone ( Heukelbach et al., 2004 ) ( Heukelbach et al., 2004 )	3.8

6. Conclusioni

L’ivermectina è un efficace agente antiparassitario che agisce contro molti parassiti intestinali (strongiloidosi, ascaridiosi, tricuriosi, anchilostomiasi, tra gli altri), ectoparassiti (scabbia, larva migrans, miasi, ecc.), così come filariosi e oncocercosi. L’ivermectina ha un buon profilo di sicurezza. La dose da 200 μg/kg a 400 μg/kg è sicura, a seconda della patologia trattata, dell’età e del peso/altezza del paziente. Il Perù è ancora, a causa delle sue condizioni sociali e ambientali, un paese con un elevato carico di parassiti intestinali ed ectoparassiti, riportato da diversi studi di ricerca. L’uso dell’ivermectina per trattare le malattie parassitarie e contro gli ectoparassiti è fattibile e può essere indicato per attività di assistenza nei bambini con una malattia parassitaria sospetta o diagnosticata. Le iniziative di welfare che prevedono la somministrazione massiva di ivermectina dovrebbero essere realizzate con un’attenta considerazione della sicurezza del farmaco per gli individui di età pari o superiore a due anni. Tuttavia, è consigliabile che gli studi sviluppino misurazioni dell’impatto di queste attività in diverse regioni.

AUTORE

^un Instituto de Evaluación de Tecnologías en Salud e Investigación, EsSalud, Lima, Perù

^bUniversità San Ignacio de Loyola, Lima, Perù

^c Facultad de Medicina Huamana, Universidad de San Martín de Porres, Chiclayo, Perù

^d Scuola di Medicina, Universidad Científica del Sur, Lima, Perù

^e Grupo de Investigación Biomedicina, Facoltà di Medicina, Fundacion Universitaria Autónoma de las Américas, Pereira, Colombia

^f Gilbert e Rose-Marie Chagoury School of Medicine, Università Libanese Americana, Beirut 1102, Libano

^g Facultad de Medicina, Universidad Privada Antenor Orrego, Trujillo, Perù

^h Instituto Nacional Cardiovascolare, INCOR, EsSalud, Lima, Perù

ⁱ Facoltà di Medicina, Universidad César Vallejo, Trujillo, Perù

^j Università Continentale, Lima, Perù

^k Ospedale Regionale Lambayeque, Chiclayo, Perù

^⁎

Autore corrispondente presso: Universidad San Ignacio de Loyola, Av La Fontana 550, La Molina, Perù vfailoc@usil.edu.pe

Codice PMI: PMC10507222 Codice PMI: 37731824

L’ivermectina sopprime la crescita del tumore e le metastasi attraverso la degradazione del PAK1 nel carcinoma squamocellulare esofageo

Astratto

Il carcinoma squamocellulare esofageo (ESCC), la forma più comune di neoplasie esofagee nella regione Asia-Pacifico, rimane una sfida clinica importante. In questo studio, abbiamo scoperto che l’ivermectina, un farmaco antiparassitario efficace che è stato approvato per i pazienti per il trattamento orale dell’oncocercosi da oltre 30 anni, ha mostrato una potente attività antitumorale contro le cellule ESCC in vitro e nei topi nudi. Abbiamo dimostrato che l’ivermectina ha inibito significativamente la vitalità cellulare e la formazione di colonie e ha indotto l’apoptosi attraverso un modo dipendente dai mitocondri nelle cellule ESCC. L’ivermectina ha anche annullato la migrazione delle cellule ESCC, l’invasione, così come i livelli proteici di MMP-2 e MMP-9. Meccanicisticamente, l’ivermectina ha fortemente inibito l’espressione di PAK1; mediante ulteriori esperimenti di guadagno e perdita di funzione, abbiamo confermato che PAK1 ha svolto un ruolo cruciale negli effetti inibitori mediati da ivermectina sulle cellule ESCC. Inoltre, i dati hanno indicato che l’ivermectina ha promosso la degradazione di PAK1 attraverso il percorso dipendente dal proteasoma. Inoltre, l’ivermectina ha sinergizzato con farmaci chemioterapici tra cui cisplatino e 5-fluorouracile per indurre l’apoptosi delle cellule ESCC. È interessante notare che gli esperimenti in vivo hanno anche confermato che l’ivermectina ha soppresso efficacemente la crescita del tumore e le metastasi polmonari dell’ESCC. Collettivamente, questi risultati indicano che l’ivermectina esercita una potente attività antitumorale contro l’ESCC ed è un promettente farmaco candidato terapeutico per i pazienti con ESCC, anche quelli portatori di metastasi.

1. INTRODUZIONE

Il cancro esofageo, l’ottavo tumore più frequente, è la sesta causa di mortalità correlata al cancro nel mondo, con oltre 455 mila persone a cui è stato diagnosticato un nuovo cancro esofageo e oltre 400 mila decessi all’anno. ¹ La maggior parte dei tumori esofagei può essere suddivisa in adenocarcinoma esofageo (EAC) e carcinoma squamocellulare esofageo (ESCC) in base ai sottotipi istologici. ² In tutto il mondo, si stima che nel 2012 si siano verificati 398 000 nuovi casi di ESCC (che rappresentano l’87% di tutti i tumori esofagei). ³ Circa l’80% del totale dei casi di ESCC a livello globale si verifica nella regione dell’Asia sudorientale e centrale, in particolare in Cina, dove contribuisce al 53% dei casi globali. ¹ Nonostante l’uso di diverse strategie, tra cui la resezione chirurgica, in combinazione con chemioterapia (cisplatino e 5-fluorouracile), radioterapia e altre tecniche moderne, la prognosi per i pazienti con ESCC è ancora scarsa, con un tasso di sopravvivenza globale a cinque anni inferiore al 20%, ⁴ principalmente a causa della mancanza di approcci clinici per la diagnosi precoce, dell’elevata incidenza di metastasi tumorali e recidiva, nonché della resistenza delle cellule tumorali alla radioterapia e alla chemioterapia. ⁵ , ⁶ , ⁷ Pertanto, vi è un’urgente necessità di trovare o sviluppare nuovi potenziali agenti terapeutici.

L’avermectina (AVM), un composto lattonico macrociclico a 16 elementi, è stato inizialmente scoperto e purificato da Streptomyces avermectinius da Ōmura e Campbell nel 1967. ⁸ , ⁹ L’avermectina ha mostrato una bioattività antiparassitaria notevolmente profonda e ha vinto il premio Nobel per la fisiologia o la medicina nel 2015. L’ivermectina è un derivato diidro dell’avermectina che si è dimostrato molto più efficace contro diversi tipi di malattie parassitarie, tra cui l’oncocercosi (nota anche come cecità dei fiumi) e la filariosi linfatica. ¹⁰ , ¹¹ Meccanicisticamente, questo composto può legarsi in modo altamente e selettivo ai canali ionici dipendenti dal glutammato (Glu-Cl) o aumentare l’attività dell’acido gamma-amminobutirrico (GABA) dipendente dal neurotrasmettitore solo in un ampio spettro di parassiti ma non nei mammiferi. ¹² , ¹³ L’ivermectina è un agente ben tollerato che è stato approvato per l’applicazione negli esseri umani per il trattamento di oncocercosi, strongiloidosi, infezioni parassitarie e altre infestazioni da vermi tra cui ascaridiasi, enterobiosi e tricuriasi. ¹⁴ , ¹⁵ Nel 2010, Sharmeen et al hanno riferito per la prima volta che l’ivermectina mostra una forte attività preclinica contro le cellule leucemiche e campioni primari di pazienti e riduce la crescita del tumore in tre diversi modelli murini di leucemia. ¹⁵ Coerentemente, un recente rapporto ha mostrato che l’ivermectina induce l’apoptosi delle cellule della leucemia mieloide cronica (LMC), ma non le cellule ematopoietiche normali, inducendo stress ossidativo e interrompendo le funzioni mitocondriali. ¹⁶ Oltre alle neoplasie ematologiche, prove crescenti hanno dimostrato che l’ivermectina è un promettente agente antineoplastico per un’ampia gamma di tumori solidi maligni, tra cui il cancro al seno, il cancro ovarico epiteliale, il melanoma, il cancro del colon e il glioma. ¹⁴ , ¹⁷ , ¹⁸ , ¹⁹ , ²⁰ Ad oggi, l’attività dell’ivermectina contro l’ESCC resta un aspetto poco esplorato.

Nello studio attuale, il nostro obiettivo era esplorare l’attività antitumorale e il suo meccanismo molecolare dell’ivermectina contro l’ESCC. I risultati hanno mostrato che l’ivermectina ha soppresso efficacemente la crescita delle cellule ESCC in vitro e in vivo e ha indotto l’apoptosi. Inoltre, l’ivermectina ha ridotto le capacità di migrazione e invasione e le metastasi nei topi nudi. Meccanicisticamente, abbiamo scoperto che PAK1 ha svolto un ruolo cruciale negli effetti inibitori mediati dall’ivermectina sulla crescita, migrazione e invasione delle cellule ESCC. Inoltre, l’ivermectina ha aumentato la sensibilità delle cellule ESCC al cisplatino (CDDP) o al 5-fluorouracile (5-FU). Nel complesso, i nostri studi hanno fornito la prima evidenza preclinica che dimostra che l’ivermectina è un promettente farmaco candidato terapeutico per i pazienti con ESCC.

2. MATERIALI E METODI

2.1. Reagenti e anticorpi

L’ivermectina (#S1351) è stata ottenuta da Selleck Chemicals. MG132 (#ab141003), CDDP (#P4394) e 5-FU (#V900394) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich. La cicloesimide (CHX, #A8244) è stata acquistata da APExBIO Technology LLC. Anticorpi contro PAK1 (#2602), Raf1 (#9422), MEK1 (#2352), PARP (#9532), fosfo-MEK1 (S298, #9128), fosfo-Raf1 (S338, #9427), Caspasi-3 (#9665), MMP-9 (#3852), MMP-2 (#4022), Caspasi-3 scissa (#9664), Bax (#5023), Bcl-xL (#2762), Mcl-1 (#5453), XIAP (#2042), Survivin (#2808), Citocromo c (#4272), AIF (#5318) e COX Ⅳ (#4850) sono stati ottenuti da Cell Signaling Technology. L’anticorpo anti-Ki67 (#ab15580) è stato ottenuto da Abcam. L’anticorpo contro l’actina (#4700) è stato ottenuto da Sigma-Aldrich. Gli anticorpi secondari coniugati alla perossidasi, tra cui IgG anti-topo di capra (#ZB-2305) e IgG anti-coniglio di capra (#ZB-2301) sono stati ottenuti da ZSBG-Bio.

3. RISULTATI

3.1. L’ivermectina inibisce la crescita delle cellule ESCC

Per accertare l’effetto antiproliferativo dell’ivermectina sulle cellule ESCC, è stato eseguito un test MTT per misurare la vitalità cellulare di quattro linee cellulari ESCC (EC109, KYSE30, KYSE70 e KYSE150) e una linea cellulare epiteliale esofagea immortalizzata (Het-1A) dopo il trattamento con ivermectina per 72 ore. Come mostrato nella Figura 1A , la vitalità cellulare di quattro linee cellulari ESCC (EC109, KYSE70, KYSE150 e KYSE30) è stata marcatamente inibita dall’ivermectina, con valori IC ₅₀ rispettivamente di 13,35, 13,86, 8,49 e 8,56 μmol/L. Mentre il valore IC ₅₀ nelle cellule Het-1A era molto più alto di quello nelle cellule ESCC, con valori IC ₅₀ di 31,21 μmol/L. Inoltre, il test dell’agar morbido ha anche mostrato che la clonogenicità delle cellule ESCC era efficacemente soppressa in modo dipendente dalla concentrazione dopo il trattamento con ivermectina (Figura 1B ).

L’ivermectina inibisce la crescita delle cellule ESCC in vitro e in vivo. (A) L’ivermectina ha inibito la vitalità delle cellule ESCC. Le cellule ESCC (KYSE70, EC109, KYSE150 e KYSE30) e una linea cellulare epiteliale esofagea immortalizzata (Het-1A) sono state esposte a concentrazioni crescenti di ivermectina per 72 ore e la vitalità cellulare è stata determinata mediante saggio MTT. ( B) Le cellule ESCC sono state seminate in coltura di agar morbido privo di farmaci e incubate per 14 giorni, le colonie sono state contate. La clonogenicità è stata espressa normalizzando al gruppo di controllo. (C-E) I topi nudi con tumori xenotrapiantati KYSE150 palpabili sono stati trattati con veicolo o ivermectina quotidianamente. I volumi del tumore misurati nei punti temporali indicati rispetto al tempo sono stati tracciati (C). Barre di errore, SD. n = 8 per gruppo. Fotografia di tumori isolati derivati da topi trattati con veicolo o ivermectina (D, in alto ). Pesi dei tumori al momento del sacrificio (D, in basso ). (E) Analisi IHC di Ki67 nei tessuti xenotrapianti di topi. Sono presentate sezioni seriali colorate con H&E degli stessi xenotrapianti. Barra della scala: 50 μm. * P < .05, ** P < .01, *** P < .001, tramite test t di Student

Per determinare l’effetto inibitorio dell’ivermectina sulla crescita delle cellule ESCC in vivo, abbiamo impiegato un modello xenotrapiantato iniettando sottocute cellule KYSE150 in topi nudi nu/nu BALB/c. Come illustrato nella Figura 1C , gli xenotrapianti trattati con ivermectina sono cresciuti a una velocità inferiore rispetto a quelli del gruppo di controllo. Analogamente, le dimensioni dei tumori trattati con ivermectina erano molto più piccole di quelle del gruppo di controllo (Figura 1D ). In modo coerente, il peso del tumore nei topi trattati con ivermectina era ridotto rispetto a quello del gruppo trattato con veicolo (Figura 1D ). Per determinare se l’ivermectina può modificare lo stato di proliferazione delle cellule ESCC in vivo, gli xenotrapianti sono stati colorati per il marcatore proliferativo Ki67 mediante analisi IHC. I risultati hanno mostrato che gli xenotrapianti derivati da topi trattati con ivermectina presentavano una colorazione Ki67 molto più debole e una proporzione minore di cellule positive a Ki67 rispetto a quella dei topi trattati con il veicolo (Figura 1E ).

Nel complesso, questi risultati hanno dimostrato che l’ivermectina sopprime efficacemente la crescita delle cellule ESCC in vitro e in vivo.

3.2. L’ivermectina provoca l’apoptosi delle cellule ESCC attraverso il percorso di segnalazione mitocondriale

Per esplorare se l’ivermectina induce l’apoptosi delle cellule ESCC, le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state pretrattate con varie dosi di ivermectina, le cellule sono state raccolte, colorate con PI e Annexin V-FITC e quindi valutate tramite citometria a flusso. Come mostrato nella Figura 2A , il trattamento con ivermectina ha portato a una notevole morte cellulare apoptotica in modo dose- e tempo-dipendente sia nelle cellule KYSE150 che KYSE30. In modo coerente, l’analisi Western blotting ha mostrato un aumento concentrazione-dipendente della scissione di PARP e dell’attivazione di Caspasi-3, l’espressione di pro-Caspasi-3 è stata costruttivamente sottoregolata, confermando ulteriormente che l’apoptosi innescata dall’ivermectina nelle cellule ESCC (Figura 2B ).

L’ivermectina induce l’apoptosi tramite il percorso mitocondriale nelle cellule ESCC. (A) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state esposte a concentrazioni crescenti di ivermectina per 48 ore o a 15 μmol/L di ivermectina per diversi periodi di tempo e le cellule apoptotiche sono state valutate tramite citometria a flusso dopo doppia colorazione con annessina V-FITC e PI In alto , sono mostrati i dot plot rappresentativi della citometria a flusso; In basso , analisi quantitativa delle cellule morte da tre esperimenti indipendenti. Le cellule morte erano la somma delle cellule con colorazione singola o doppia con annessina V o PI. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ANOVA unidirezionale con confronto intergruppo post hoc tramite il test di Tukey. (B, C) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state esposte a varie concentrazioni di ivermectina per 48 ore, è stata eseguita un’analisi immunoblotting per rilevare le proteine apoptotiche. L’actina è servita come controllo di caricamento. (D) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state trattate con o senza 5 μmol/L di ivermectina per durate crescenti, quindi il potenziale della membrana mitocondriale è stato valutato tramite citometria a flusso dopo la colorazione con Rh123. A destra : risultati di cinque esperimenti indipendenti. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ANOVA unidirezionale con confronto intergruppo post hoc tramite il test di Tukey. (E) L’ivermectina ha indotto il rilascio di citocromo c e AIF nel citosol nelle cellule ESCC. I livelli di citocromo c e AIF negli estratti citosolici preparati con tampone digitonina sono stati esaminati tramite analisi western blotting. La COX Ⅳ è servita come indicatore mitocondriale per escludere la contaminazione delle frazioni citosoliche dai mitocondri. L’α-tubulina è servita come controllo interno

Per chiarire il meccanismo molecolare sottostante all’apoptosi indotta dall’ivermectina, è stata impiegata l’analisi immunoblotting per rilevare l’effetto dell’ivermectina sulle proteine correlate all’apoptosi. Come mostrato nella Figura 2C , dopo il trattamento con ivermectina, l’espressione delle proteine anti-apoptotiche, tra cui le proteine della famiglia IAP (XIAP e Survivin) e i membri della famiglia Bcl-2 (Bcl-xL, Bcl-2 e Mcl-1), è stata notevolmente inibita; al contrario, la proteina pro-apoptotica Bax è stata notevolmente sovraregolata (Figura 2C ). Per esplorare ulteriormente il meccanismo sottostante all’apoptosi cellulare mediata dall’ivermectina, le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state incubate con 5 μmol/L di ivermectina per diversi periodi di tempo e poi colorate con rodamina 123 (Rh123), l’MMP è stato misurato mediante analisi citofluorimetrica. Come illustrato nella Figura 2D , l’MMP è stato significativamente sottoregolato in modo dipendente dal tempo, il che era in linea con altri indici apoptotici tra cui la scissione di PARP e la Caspasi-3 attiva (Figura 2B ). Successivamente, abbiamo esplorato se l’ivermectina innesca il rilascio di Citocromo c nel citosol. L’analisi dell’immunoblotting ha mostrato che il trattamento con ivermectina ha portato a una regolazione positiva dipendente dal tempo di AIF e Citocromo c nel citoplasma (Figura 2E ). Nel complesso, questi risultati indicano che l’ivermectina induce l’apoptosi delle cellule ESCC attraverso il percorso di segnalazione mitocondriale.

3.3. L’ivermectina sopprime la migrazione e l’invasione delle cellule ESCC

Abbiamo poi esplorato se l’ivermectina sopprime la migrazione e l’invasione, due importanti caratteristiche caratteristiche coinvolte nelle metastasi del cancro, incluso l’ESCC. Nel test di guarigione delle ferite, dopo il trattamento con 2,5 μmol/L di ivermectina per 24 ore, la migrazione delle cellule KYSE150 e KYSE30 è stata drasticamente soppressa, l’inibizione è stata ulteriormente migliorata dopo l’incubazione con ivermectina per 48 ore (Figura 3A ). In linea con questi risultati, il test di migrazione transwell ha rivelato che la capacità migratoria è stata notevolmente attenuata dall’ivermectina alla concentrazione di 2,5 μmol/L in entrambe le linee cellulari ESCC testate (Figura 3B ). Esploriamo anche se l’ivermectina ha un effetto inibitorio sull’invasione delle cellule ESCC utilizzando il test di invasione transwell. È interessante notare che i dati hanno mostrato che l’ivermectina ha fortemente ridotto l’invasione delle cellule KYSE150 e KYSE30, rispetto ai corrispondenti gruppi di controllo (Figura 3C ). In modo coerente, i livelli proteici di MMP-9 e MMP-2, due importanti membri della famiglia delle metalloproteinasi della matrice (MMP), sono stati notevolmente sottoregolati in modo dose-dipendente sia nelle cellule KYSE150 che KYSE30 (Figura 3D ). Nel complesso, questi dati suggeriscono che l’ivermectina sopprime efficacemente la migrazione e l’invasione delle cellule ESCC.

L’ivermectina sopprime la migrazione, l’invasione e la metastasi delle cellule ESCC. (A) Le cellule KYSE150 e KYSE30 trattate con o senza 2,5 μmol/L di ivermectina sono state sottoposte a test di guarigione delle ferite. In alto : immagini rappresentative sono state registrate a 0 h, 24 h, 48 h. In basso : analisi quantitativa dell’ampiezza relativa della ferita da cinque esperimenti indipendenti. L’ampiezza della ferita è stata normalizzata al punto temporale iniziale (0 h). Le colonne e le barre di errore rappresentano la media ± SD (n = 5 per gruppo). (B, C) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state pretrattate con 2,5 μmol/L di ivermectina per 48 h e quindi sottoposte a test di migrazione transwell (B) e invasione (C). Sinistra : immagini rappresentative; Destra : analisi quantitativa di cinque esperimenti indipendenti. Barra della scala: 100 μm. Media; barra di errore, SD. (D) Analisi Western blotting di lisati cellulari interi di cellule KYSE150 e KYSE30 pretrattate con diverse concentrazioni di ivermectina per 48 ore. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, tramite test t di Student . (E) Le cellule KYSE150 sono state iniettate per via endovenosa in topi nudi tramite la vena laterale della coda. Sinistra : immagini rappresentative di polmoni (pannello superiore) e sezioni polmonari colorate con H&E (pannello inferiore) raccolte 8 settimane dopo l’iniezione (le frecce indicano i tumori metastatici). Destra : sono stati contati i noduli metastatici superficiali nei polmoni. I dati rappresentano la media ± SD (n = 8 per gruppo). Barra della scala, 200 μm. *** P < 0,001 tramite test t di Student

3.4. L’ivermectina riduce le metastasi dell’ESCC nei topi nudi

Dato che l’ivermectina potrebbe ovviamente attenuare la migrazione e le capacità invasive delle cellule ESCC in vitro, abbiamo quindi studiato se l’ivermectina inibisce la metastasi tumorale in vivo. È stato eseguito un modello murino di metastasi polmonare iniettando per via endovenosa cellule KYSE150 in topi nudi tramite vene laterali della coda e somministrando un trattamento con ivermectina per 14 giorni. Come illustrato nella Figura 3E , l’ivermectina ha ridotto sostanzialmente la capacità di metastasi polmonare, come indicato dal numero ridotto di metastasi polmonari nel polmone di ciascun animale, rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, i risultati della colorazione H&E hanno rivelato una riduzione evidente del numero di cellule nude metastatiche e delle dimensioni del tumore nei polmoni dei topi trattati con ivermectina, rispetto a quelli del gruppo di controllo (Figura 3E ). Nel complesso, questi risultati in vivo indicano che l’ivermectina riduce efficacemente la metastasi tumorale dell’ESCC.

3.5. L’ivermectina inibisce la crescita, la migrazione e l’invasione delle cellule ESCC tramite la down-regulation di PAK1

Prove crescenti hanno dimostrato che un’elevata espressione di PAK1 è stata osservata in vari tumori, tra cui l’ESCC, e PAK1 ha svolto un ruolo cruciale nella regolazione della crescita tumorale e delle metastasi. ⁵ Pertanto, determiniamo se PAK1 è inibito nelle cellule ESCC trattate con ivermectina. Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state pretrattate con concentrazioni crescenti di ivermectina; le cellule sono state raccolte e sottoposte ad analisi Western blotting di PAK1. Come illustrato nella Figura 4A , l’ivermectina ha inibito notevolmente l’espressione di PAK1 in modo dose-dipendente. È interessante notare che anche la fosforilazione di Raf1 (S338) e MEK1 (S298), due substrati a valle convalidati di PAK1, ²⁸ , ²⁹ è stata ovviamente soppressa dall’ivermectina (Figura 4B ). In modo coerente, i livelli proteici di PAK1, p-Raf1 (S338) e p-MEK1 (S298) sono risultati notevolmente ridotti negli xenotrapianti tumorali derivati da topi trattati con ivermectina, rispetto ai controlli trattati con veicolo (Figura 4B ).

Figura 4.

L’ivermectina sopprime la crescita cellulare, la migrazione e l’invasione attraverso la down-regulation di PAK1 nelle cellule ESCC. (A) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state trattate con le concentrazioni indicate di ivermectina per 48 ore, quindi l’espressione di PAK1 e dei suoi target a valle è stata analizzata tramite Western blotting. (B) Analisi tramite Western blotting dei lisati interi derivati da tessuti tumorali xenotrapiantati di topi trattati con veicolo o ivermectina. (C-F) Le cellule KYSE150 trasdotte stabilmente con plasmidi PAK1 o costrutti lentivirali PAK1-shRNA sono state trattate con o senza ivermectina per 48 ore. I lisati cellulari interi sono stati utilizzati per misurare l’espressione di PAK1 tramite immunoblotting (C). Le cellule ESCC sono state raccolte e sottoposte a saggi di agar morbido (D), migrazione transwell (E) e invasione (F). ns: nessuna differenza significativa; * P < .05, ** P < .01, *** P < .001, ANOVA unidirezionale con confronto intergruppo post hoc tramite il test di Tukey

Per esplorare ulteriormente se PAK1 è coinvolto nell’effetto inibitorio mediato dall’ivermectina sulle cellule ESCC. Le cellule KYSE150 sono state sottoposte a sovraespressione stabile di PAK1, seguite da trattamento senza o con ivermectina per quarantotto ore e poi sottoposte a esperimenti di migrazione transwell e invasione su agar morbido. I risultati hanno mostrato che l’espressione di PAK1 era molto più alta nelle cellule KYSE150-PAK1 rispetto a quelle cellule transfettate con vettore vuoto (Figura 4C , pannello di sinistra ). Nel test su agar morbido, la sovraespressione ectopica di PAK1 non solo ha aumentato le capacità di formazione di colonie, ma ha anche attenuato significativamente l’inibizione della formazione di colonie indotta dall’ivermectina (Figura 4D , pannello di sinistra ). Inoltre, la sovraespressione di PAK1 ha quasi completamente ripristinato gli effetti inibitori dell’ivermectina sulla migrazione (Figura 4E ) e sull’invasione (Figura 4F ) nelle cellule KYSE150. Viceversa, l’abbattimento di PAK1 da parte di shRNA lentivirale (Figura 4C , pannello destro ) ha soppresso significativamente la formazione di colonie (Figura 4D , pannello destro ), la migrazione (Figura 4E ) e l’invasione (Figura 4F ), simili ai risultati mediati dall’ivermectina. Ancora più importante, il silenziamento di PAK1 ha migliorato l’abrogazione della formazione di colonie (Figura 4D , pannello destro ), della migrazione (Figura 4E ) e dell’invasione (Figura 4F ) indotte dall’ivermectina. Questi dati hanno confermato che PAK1 è coinvolto negli effetti inibitori mediati dall’ivermectina sulle cellule ESCC.

3.6. L’ivermectina promuove la degradazione di PAK1 attraverso il percorso dipendente dal proteasoma

Per chiarire il meccanismo molecolare sottostante con cui l’ivermectina ha regolato negativamente il livello proteico di PAK1, è stata condotta un’analisi qRT-PCR per quantificare l’espressione di mRNA di PAK1. Tuttavia, non c’era alcuna differenza evidente tra le cellule ESCC trattate con ivermectina e i gruppi di controllo nella regolazione del livello di mRNA di PAK1 (Figura 5A ), suggerendo che la regolazione negativa di PAK1 mediata dall’ivermectina potrebbe non essere a livello di trascrizione. Abbiamo quindi studiato se la degradazione di PAK1 indotta dall’ivermectina è a livello post-traduzionale utilizzando cicloesimide (CHX), un inibitore della sintesi proteica. Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state pretrattate con 2,5 μmol/L di ivermectina per 36 ore, seguite da un trattamento aggiuntivo senza o con CHX (50 μg/mL) per 0-12 ore. I risultati dell’immunoblotting hanno mostrato che è stato osservato un tasso di turnover alterato nella proteina PAK1 nelle cellule KYSE150 trattate con ivermectina (Figura 5B ). Allo stesso modo, anche gli esperimenti di time chase hanno mostrato un aumento della degradazione del livello di PAK1 nelle cellule KYSE30 trattate con ivermectina, rispetto ai controlli (Figura 5C ). Abbiamo quindi esplorato se la degradazione di PAK1 indotta dall’ivermectina avvenisse attraverso il percorso di segnalazione dipendente dal proteasoma. È interessante notare che, in seguito all’esposizione a MG132 (un inibitore specifico del proteasoma), l’espressione della proteina PAK1 è stata drasticamente ripristinata rispetto ai gruppi trattati con sola ivermectina in entrambe le linee cellulari di ESCC testate (Figura 5D ), suggerendo che la degradazione di PAK1 innescata dall’ivermectina avviene tramite il percorso di segnalazione dipendente dal proteasoma nelle cellule ESCC.

Figura 5.

L’ivermectina promuove la degradazione dell’ubiquitina di PAK1. (A) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state trattate con le concentrazioni indicate di ivermectina per 48 ore, quindi l’espressione di mRNA di PAK1 è stata valutata tramite qRT-PCR. (B, C) Le cellule KYSE150 (B) e KYSE30 (C) sono state trattate con 2,5 μmol/L di ivermectina per 36 ore, seguite da un trattamento con cicloesimide (CHX, 50 μmol/L) per altre 0-12 ore. I lisati cellulari interi sono stati estratti per il Western blotting con anticorpo anti-PAK1 ( sinistra ). Sono stati eseguiti esperimenti triplicati per l’analisi statistica ( destra ). (D) Analisi immunoblotting dell’espressione di PAK1 nelle cellule ESCC pretrattate con MG132 (5 μmol/L) per 2 ore, e poi con o senza trattamento con ivermectina 2,5 μmol/L per 48 ore. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, mediante test t di Student

3.7. L’ivermectina agisce in sinergia con CDDP e 5-FU per indurre l’apoptosi delle cellule ESCC

Prove crescenti hanno dimostrato che i nuovi agenti terapeutici in combinazione con farmaci chemioterapici convenzionali sono più efficaci di ogni tipo di agente da solo per migliorare la qualità della vita dei pazienti con ESCC. ³⁰ , ³¹ CDDP e 5-FU sono due farmaci chemioterapici di prima linea in uso per l’ESCC. ³⁰ Abbiamo quindi esaminato l’efficienza dell’ivermectina combinata con CDDP o 5-FU nelle cellule KYSE150 e KYSE30. Le cellule sono state trattate con ivermectina da sola o in combinazione con l’agente chemioterapico indicato, tre giorni dopo, la vitalità cellulare è stata eseguita tramite test MTT e l’effetto combinato è stato valutato in base all’indice di combinazione (CI). Come mostrato nella Figura 6A , c’era un effetto sinergico tra ivermectina e CDDP o 5-FU nel ridurre la vitalità cellulare delle due cellule ESCC testate. Con un altro esperimento, le cellule ESCC sono state esposte a 2,5 μmol/L di ivermectina con una combinazione di 12,5 μmol/L di CDDP o 5-FU (200 μmol/L) per 48 ore, la percentuale di cellule cancerose morte è stata rilevata utilizzando il test di esclusione del blu di tripano. I risultati hanno mostrato che l’ivermectina da sola non ha mostrato alcuna tossicità evidente per le cellule KYSE150 e KYSE30, e sia CDDP che 5-FU hanno semplicemente innescato una morte cellulare minima. Tuttavia, la combinazione di ivermectina e CDDP o 5-FU ha portato a un notevole aumento del rapporto di morte cellulare (Figura 6B , D ). In modo coerente, anche l’analisi dell’immunoblotting ha confermato che l’ivermectina ha migliorato l’apoptosi indotta da CDDP, come dimostrato dall’attivazione della caspasi-3 e dalla scissione di PARP nelle cellule KYSE150 e KYSE30 (Figura 6C ). Risultati simili sono stati osservati quando l’ivermectina è stata combinata con 5-FU (Figura 6D ). Questi risultati suggeriscono che il regime combinato di ivermectina e CDDP o 5-FU fornisce un nuovo approccio terapeutico per i pazienti con ESCC.

Figura 6.

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L’ivermectina è sinergica con CDDP e 5-FU. (A) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state esposte a una miscela diluita in serie a un rapporto fisso di ivermectina e CDDP o 5-FU per 72 ore, la vitalità cellulare è stata misurata mediante saggio MTT. Il metodo dell’effetto mediano di Chou e Talalay è stato utilizzato per valutare l’effetto sinergico. L’indice di combinazione (CI) era il rapporto tra la dose di combinazione e la somma delle dosi del singolo agente a un livello isoefficace. CI < 1 indica sinergia e CI = 1 indica additivo. (B) e (D) Le cellule KYSE150 e KYSE30 sono state esposte a ivermectina (2,5 μmol/L) con combinazione di CDDP (12,5 μmol/L) o 5-FU (200 μmol/L) per 48 ore, e poi esaminate con un emocitometro mediante saggio di esclusione del blu di tripano (n = 6 per gruppo). Colonna, media; barra di errore, SD. ***, P < .001, ANOVA unidirezionale con confronto intergruppo post hoc con il test di Tukey. (C) e (E) Analisi del Western blotting del PARP scisso e della Caspasi-3. – indica l’assenza e + indica la presenza dei farmaci

4. DISCUSSIONE

In questo studio, abbiamo scoperto che l’ivermectina era efficace nel sopprimere la crescita, la migrazione e l’invasione delle cellule ESCC. Ancora più importante, i nostri dati hanno anche mostrato che l’ivermectina aveva un’elevata attività antitumorale contro la crescita del tumore e le metastasi nei modelli di topi nudi. Inoltre, l’ivermectina ha indotto l’apoptosi e ha migliorato l’inibizione della crescita cellulare indotta da CDDP o 5-FU. A nostra conoscenza, questo è il primo studio a indagare l’attività antitumorale dell’ivermectina contro l’ESCC in vitro e in vivo.

Divulgare nuovi usi per vecchi farmaci è spesso molto più economico e veloce che sviluppare nuovi farmaci da zero. ³² , ³³ In questo studio, abbiamo scoperto che l’ivermectina, che è stata approvata per il trattamento di malattie umane negli Stati Uniti e in altri paesi per oltre 30 anni, ha mostrato una potente attività antitumorale contro l’ESCC sia in vitro che in modelli di topi nudi. In linea con i nostri risultati, alcuni studi hanno dimostrato che l’ivermectina ha mostrato una potente attività antitumorale contro diversi tumori maligni come il glioma, il cancro al seno, il cancro polmonare non a piccole cellule e il cancro del colon in vitro e in topi nudi. ¹⁴ , ¹⁷ , ²⁰

In questo studio, abbiamo anche notato che l’ivermectina ha indotto drasticamente l’apoptosi in entrambe le cellule ESCC testate sulla base dei seguenti fatti: (a) il trattamento con ivermectina ha determinato un aumento delle proporzioni di cellule leganti l’annessina V in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo; (b) è stata osservata un’attivazione specifica della caspasi-3 e della PAPP durante il trattamento con ivermectina; (c) i livelli di proteine pro-sopravvivenza tra cui XIAP, Survivin, Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 erano sottoregolati, mentre la proteina pro-apoptotica Bax era sovraregolata nelle cellule ESCC trattate con ivermectina. (d) il trattamento con ivermectina ha portato a una sottoregolazione dipendente dal tempo del potenziale transmembrana mitocondriale e al rilascio di AIF e citocromo c dai mitocondri al citosol. In linea con i nostri risultati, Melotti A e colleghi hanno scoperto che il trattamento con ivermectina ha portato a un aumento di sette volte del numero di cellule Caspasi-3 positive attivate sia nelle linee primarie che in quelle cellulari del cancro del colon. ¹⁴ Inoltre, l’ivermectina ha anche indotto l’apoptosi delle cellule del cancro ovarico epiteliale (EOC) e ha promosso i livelli proteici di PARP scissa, Bax, p27 e p21. ¹⁸ Mentre Dou et al hanno riferito che l’ivermectina non ha indotto l’apoptosi cellulare, ma ha stimolato significativamente l’autofagia citostatica nelle cellule del cancro al seno. ¹⁷ Nel complesso, questi risultati suggeriscono che l’induzione dell’apoptosi cellulare da parte dell’ivermectina può dipendere dal contesto del tumore.

Le metastasi tumorali sono una delle cause principali che portano al fallimento del trattamento nei pazienti con ESCC. Processi multifase tra cui l’adesione delle cellule tumorali, la migrazione e l’invasione nei vasi o nei tessuti adiacenti sono coinvolti nelle metastasi tumorali. In questo rapporto, utilizzando saggi di migrazione scratch e transwell, l’ivermectina ha mostrato un’attività altamente inibitoria contro la migrazione delle cellule ESCC. Inoltre, abbiamo anche scoperto che l’ivermectina ha soppresso efficacemente l’invasione delle cellule ESCC. MMP-9 e MMP-2 sono due membri chiave della famiglia delle MMP che sono in grado di degradare le membrane basali e la matrice extracellulare e quindi facilitare l’invasione e la metastasi delle cellule tumorali maligne in altri organi o tessuti. ³⁴ Curiosamente, i livelli proteici di MMP-2 e MMP-9 sono stati ovviamente soppressi dall’ivermectina. Ancora più importante, abbiamo anche scoperto che l’ivermectina ha soppresso notevolmente le metastasi polmonari nei modelli di topi nudi. In modo coerente, Kwon et al hanno riferito che il trattamento con ivermectina ha soppresso l’invasione cellulare e ha regolato positivamente l’espressione dell’E-caderina nelle cellule del carcinoma mammario triplo negativo (TNBC). ³⁵ Allo stesso modo, dopo il trattamento con ivermectina, anche la capacità invasiva delle cellule del glioma è stata potenzialmente inibita. ²⁰ Nel complesso, i nostri dati suggeriscono che l’ivermectina è un promettente agente terapeutico per i pazienti con cancro maligno con metastasi.

PAK1, un membro delle chinasi attivate da P21 (PAK), è un’importante proteina chinasi serina/treonina che può essere attivata dalla piccola famiglia Rho delle GTPasi (Rac1 e Cdc42). ³⁶ Si dimostrano sempre più numerose indicate che PAK1 è sovraespresso in diversi tumori maligni come il carcinoma polmonare non a piccole cellule, il carcinoma mammario, il carcinoma epatocellulare e il carcinoma pancreatico, e un’elevata espressione di PAK1 è positivamente associata a un elevato rischio di recidiva del tumore e metastasi, e a una scarsa sopravvivenza. ³⁷ , ³⁸ , ³⁹ , ⁴⁰

In modo coerente, abbiamo recentemente scoperto che PAK1 è altamente espresso nell’ESCC e che il targeting di PAK1 tramite inibizione genetica o farmacologica ha drasticamente soppresso la crescita cellulare, la migrazione, l’invasione e le metastasi. ⁵ Tutti questi risultati indicano che PAK1 è un potenziale bersaglio terapeutico per diversi tumori, incluso l’ESCC.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato che l’ivermectina ha soppresso la crescita, la migrazione e l’invasione delle cellule ESCC inducendo la degradazione di PAK1 tramite il percorso di dipendenza dipendente dal proteasoma, e la conclusione si basa sui seguenti effetti: (a) l’ivermectina ha inibito notevolmente l’espressione della proteina PAK1 sia nelle linee cellulari ESCC testate che negli xenotrapianti tumorali, ma non ha avuto alcun effetto evidente sul livello di mRNA di PAK1, indicando che la down-regulation di PAK1 mediata dall’ivermectina potrebbe non essere a livello di trascrizione. (b) il silenziamento di PAK1 ha ovviamente migliorato gli effetti inibitori dell’ivermectina sulla formazione, la migrazione e l’invasione delle colonie; al contrario, l’espressione forzata di PAK1 ha determinato un fenomeno completamente opposto; (c)

Gli esperimenti di inseguimento temporale in presenza di CHX hanno mostrato che è stato osservato un aumento del tasso di degradazione del livello di PAK1 nelle cellule ESCC trattate con ivermectina, rispetto a quello dei controlli, suggerendo che l’ivermectina ha down-regolato PAK1 a livello post-traduzionale; (d) La down-regolazione di PAK1 indotta dall’ivermectina potrebbe essere notevolmente ripristinata dall’inibitore specifico del proteasoma MG132 in entrambe le linee cellulari testate di ESCC. In linea con i nostri risultati, Dou et al hanno riferito che l’ivermectina potrebbe indurre l’autofagia delle cellule del cancro al seno promuovendo la degradazione di PAK1 tramite il percorso di ubiquitinazione. ¹⁷

Gli agenti chemioterapici tradizionali CDDP e 5-FU sono agenti chemioterapici comunemente usati per i pazienti con ESCC localmente avanzato. ⁴¹ Tuttavia, gli effetti collaterali e i tassi di sopravvivenza sono rimasti insoddisfacenti, con il 25% di tossicità tardive di grado 3, il 42% di tossicità acute e il tasso di sopravvivenza complessivo a cinque anni era solo del 26%. ⁴¹ , ⁴² In questo studio, i dati hanno mostrato che c’era un effetto inibitorio sinergico tra ivermectina e CDDP o 5-FU nel ridurre la vitalità delle cellule ESCC. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’ivermectina ha migliorato la sensibilità delle cellule ESCC a questi farmaci citotossici in parte inducendo l’apoptosi cellulare, come dimostrato dall’attivazione specifica di PARP e Caspasi-3. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che il trattamento con ivermectina potrebbe ridurre la dose efficace di agenti chemioterapici e migliorare gli effetti antitumorali di questi agenti. In modo coerente, Sharmeen S et al hanno scoperto che l’ivermectina potrebbe agire in sinergia con la daunorubicina e la citarabina per innescare la morte cellulare nelle cellule leucemiche. ¹⁵ Inoltre, Kodama et al hanno riferito che l’ivermectina in combinazione con il paclitaxel ha mostrato un effetto antitumorale più forte sul carcinoma ovarico epiteliale (EOC) rispetto a entrambi i farmaci da soli sia in vitro che in vivo. ¹⁸ Nel complesso, questi risultati da noi e da altri suggeriscono che la combinazione di ivermectina con i farmaci di trattamento standard è una potenziale strategia terapeutica per i pazienti oncologici. Pertanto, il lavoro futuro deve indagare ulteriormente l’efficacia dell’ivermectina in combinazione con agenti chemioterapici tradizionali nei modelli murini e negli studi clinici di ESCC.

In sintesi, il nostro studio ha dimostrato che l’ivermectina ha soppresso efficacemente la crescita, la migrazione e l’invasione delle cellule ESCC bloccando la segnalazione PAK1. Abbiamo anche scoperto che l’ivermectina ha mostrato significativi effetti antitumorali sulla tumorigenesi e sulle metastasi polmonari nei modelli di topi xenotrapiantati e ha migliorato la sensibilità ai farmaci chemioterapici di prima linea, tra cui CDDP o 5-FU. Dato che l’ivermectina è stata approvata dalla FDA per il trattamento delle malattie umane, i nostri dati giustificano uno studio clinico sull’ivermectina per il trattamento dei pazienti con ESCC, anche quelli con metastasi o resistenza chemioterapica.

CONTRIBUTO DELL’AUTORE

Liang Chen ha progettato, eseguito esperimenti, analizzato dati e redatto il manoscritto; Shuning Bi e Qiuren Wei hanno eseguito esperimenti; Zhijun Zhao ha guidato la ricerca e analizzato i dati; Chaojie Wang e Songqiang Xie hanno progettato, guidato la ricerca e scritto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

RINGRAZIAMENTI

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (n. 81772832 e n. 81573465 a S. Xie), dal Key Project of Science and Technology Research Funded by the Educational Commission of Henan Province (n. 20A350002 a L. Chen), dal progetto scientifico e tecnologico del Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia di Henan (n. 202102310156 a L. Chen), dalla sponsorizzazione della ricerca post-dottorato del Luohe Medical College (n. PR20180001 a L. Chen) e dal Program for Innovative Research Team (in Science and Technology) presso l’Università della Provincia di Henan (n. 19IRTSTHN004 a S. Xie).

Chen L, Bi S, Wei Q, Zhao Z, Wang C, Xie S. L’ivermectina sopprime la crescita del tumore e le metastasi attraverso la degradazione di PAK1 nel carcinoma squamocellulare esofageo. J Cell Mol Med. 2020;24:5387–5401. 10.1111/jcmm.15195

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