Ivermectina 6

July 18, 2025

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La FDA ha definitivamente perso la causa sull’Ivermectina ed è stata costretta a rimuovere tutti i post sui social in cui la criminalizzava.

“Questo medicinale è il più sicuro ed efficace che sia mai stato prodotto dagli scienziati”.

Qualcuno lo dica all’inutile veterinaria Ilaria Capua e a tutte le ridicole virostar che impestano i merdia con le loro cazzate! Vale la pena ricordare che diversi studi hanno dimostrato la sua efficacia anche nella cura di alcune tipologie di tumore.

La FDA perde la sua guerra contro l’ivermectina e accetta di rimuovere tutti i post sui social media e le direttive dei consumatori riguardanti l’ivermectina e il COSO-19, compreso il suo tweet più popolare nella storia della FDA.

“È più probabile che tu muoia prendendo l’aspirina o il Tylenol che prendendo l’ivermectina.”

Senatore Ron Johnson condivide il grafico più censurato nella storia del Congresso:

🗣Confronto degli eventi avversi dei farmaci (01/01/1996 – 27/10/23)

🔴Ivermectina – 4.265

🔴HCQ – 28.823

🔴Vaccino antinfluenzale – 220.346

🔴Desametasone – 110.185

🔴Tylenol – 136.079

🔴Remdesivir – 9.290

🔴Vaccini COVID – 1.605.764

FATE UN GRANDISSIMO Omaggio AL professor Satoshi Ōmura che l’ha scoperta.”

Dott. Thomas Lodi (oncologo): Ivermectina, Fenbendazolo e altri antiparassitari sono un’alternativa alla chemioterapia per alcuni casi di cancro. Sono trattamenti alternativi che (ovviamente) non interessano alle aziende farmaceutiche né al sistema sanitario.

I pazienti affetti da cancro riferiscono di guarire con il trattamento con Ivermectina

➡️ Sembra che l’ivermectina sia efficace anche contro il cancro.

🩺 Il famoso oncologo, radiologo e immunologo Dr. William Makis ora riferisce che un paziente con cancro alla prostata allo stadio 4 ha avuto una guarigione sorprendente.

✍️ Il brevetto dell’ivermectina è scaduto e pertanto non è più un buon affare per i prodotti farmaceutici.

➡️ Ecco perché si cerca di minimizzarne gli effetti e i media mainstream lo diffamano definendolo un “vermifugo per cavalli”.

➡️ Oltre al suo effetto sulle infezioni respiratorie, ha anche un forte effetto sul cancro.

➡️ Questo perché gli studi hanno scoperto che il cancro ha almeno 15 meccanismi d’azione antitumorali.

➡️ Quindi non solo conosciamo i successi della guarigione, ma anche perché e come avviene la guarigione.

Premessa

Pazienti oncologici guariscono grazie a farmaci antiparassitari riadattati

A Joe Tippens erano stati dati tre mesi di vita, ma un farmaco antiparassitario ha cambiato il corso della sua vita e la sua missione.

SALUTO

Di Huey Freeman

25 giugno 2025, 18:49

Joe Tippens non avrebbe mai pensato di scoprire una cura che gli avrebbe salvato la vita e lo avrebbe reso uno dei più famosi sopravvissuti al cancro. L’imprenditore 67enne voleva semplicemente sconfiggere un tipo di cancro con un tasso di sopravvivenza estremamente basso.

Nell’agosto 2016, a Tippens è stato diagnosticato un carcinoma polmonare a piccole cellule, un tumore delle dimensioni di un pugno. Dopo essere stato sottoposto a chemioterapia e radioterapia cinque volte a settimana a Houston, il grosso tumore nel polso sinistro è stato rimosso. Tuttavia, Tippens ha affermato che i trattamenti erano più vicini a ucciderlo che a curarlo.

Quando tornò a casa in Oklahoma dopo Capodanno, ricevette una notizia devastante. Il suo oncologo le disse che non aveva alcuna possibilità di sopravvivere più di qualche mese.

“Nel gennaio 2017, la mia PET si illuminò come un albero di Natale e avevo metastasi diffuse in tutto il corpo, inclusi collo, ossa, pancreas e fegato”, ha raccontato Tippens.

Trovare una via d’uscita

Di fronte a una prognosi di tre mesi di vita, Tippens sentì una storia intrigante da un veterinario che conosceva: una scienziata con un cancro terminale aveva curato i suoi topi da laboratorio e poi se stessa usando il fenbendazolo, un farmaco antiparassitario.

Inibiscono la divisione cellulare nelle cellule tumorali.
– Influenzano la funzione mitocondriale: riducono l’energia cellulare, aumentano lo stress ossidativo e bloccano una via critica che regola la crescita cellulare nelle cellule tumorali.

I ricercatori dello Stanford University Medical Center hanno pubblicato diversi casi clinici in cui il fenbendazolo è stato utilizzato per curare il cancro allo stadio IV, secondo Makis. La serie di casi è stata pubblicata nel 2021 su SciTechnol, una casa editrice online londinese di articoli scientifici.

Una revisione stimolante, che cita studi su animali pubblicati nel 2024 sull’Anticancer Research Journal, ha concluso che il fenbendazolo influenza il metabolismo energetico, principalmente aumentando i livelli di p53 e influenzando le vie che controllano l’assorbimento degli zuccheri.

In definitiva, affama le cellule tumorali e le fa morire con danni minimi alle cellule sane. I ricercatori hanno concluso che gli effetti del fenbendazolo sul metabolismo energetico potrebbero portare a progressi significativi nel trattamento del cancro.

Alcune ricerche preliminari hanno anche suggerito potenziali meccanismi antitumorali del fenbendazolo. Uno studio pubblicato su Scientific Reports nel 2018 da ricercatori indiani ha scoperto che il fenbendazolo “può essere valutato come potenziale agente terapeutico grazie al suo effetto su molteplici vie cellulari che portano all’eliminazione efficace delle cellule tumorali”. Nello specifico, il fenbendazolo interferisce con i microtubuli coinvolti nella divisione cellulare.

Uno studio del 2016 pubblicato su Biochemical and Biophysical Research Communications ha scoperto che l’ivermectina, un farmaco antiparassitario approvato per uso umano, si è dimostrato promettente contro il glioblastoma, un tumore cerebrale aggressivo noto per la sua resistenza ai trattamenti.

Il farmaco uccide le cellule di glioblastoma e inibisce lo sviluppo dei vasi sanguigni.

In studi di laboratorio e su topi, l’ivermectina causa la morte delle cellule tumorali e riduce significativamente la crescita tumorale.

Ricerche recenti hanno dimostrato che una combinazione di fenbendazolo e diisopropilammino dicloroacetato, un composto utilizzato per il trattamento dell’epatite, ha mostrato alcune proprietà antitumorali in colture cellulari e studi su animali.

I farmaci uccidono le cellule tumorali polmonari in modo più efficace rispetto a entrambi i farmaci singolarmente.

Makis ha scoperto che la combinazione di fenbendazolo e ivermectina può aumentare l’efficacia del protocollo.

“Quando li si combina, si passa dall’attaccare il cancro in una dozzina di modi all’attaccarlo in una ventina di modi”, afferma Makis.

“Penso che abbia perfettamente senso includerli entrambi nei protocolli se esistono ricerche precliniche che dimostrano che ognuno ha un effetto su quel particolare tumore. Ogni volta che si tratta di un tumore specifico, voglio esaminare l’insieme delle ricerche per verificare se esiste un effetto comprovato dell’ivermectina o del fenbendazolo su quel tumore. Se esiste, condivido questa ricerca con i miei pazienti.”

Makis ha trattato pazienti con una varietà di tumori, dai più comuni, come il cancro al seno, alla prostata, al colon e ai polmoni, a quelli più rari, come il colangiocarcinoma (tumore delle vie biliari) e i sarcomi (tumori dei tessuti molli).

“Ho avuto diversi pazienti che sono stati dichiarati guariti dal cancro dopo aver seguito il protocollo per diversi mesi”, racconta Makis.

Sebbene Makis raccomandi ivermectina e fenbendazolo per il trattamento del cancro, riconosce che molti medici si astengono dal farlo.

I medici sono molto riluttanti ad aiutare i pazienti oncologici con farmaci riadattati a causa delle ripercussioni delle commissioni mediche, afferma Makis.

“D’altra parte, ci sono medici disposti ad aiutare i pazienti con farmaci riadattati, ma non hanno competenze oncologiche”, aggiunge.

Alla domanda se consigliasse ai pazienti oncologici di consultare un medico integrato che approvi questi trattamenti, Makis ha risposto che è positivo per il paziente avere un rapporto con un medico con esperienza in oncologia.

“Dipende dalla formazione del medico”, ha detto Makis. “Alcuni medici hanno una vasta esperienza, avendo curato pazienti oncologici per molti anni.” Storie di successo di pazienti

Donna Leland, 64 anni, conduttrice di un talk show sulla rete radiofonica nazionale Moody Radio Network, ha ricevuto una diagnosi di cancro cervicale ed endometriale in stadio 3 nell’aprile 2023. Si è sottoposta a isterectomia, ma ha rifiutato la chemioterapia e la radioterapia raccomandate.

Motivo: “Centinaia di persone mi hanno detto di credere e di fidarsi di me perché faccio tutto questo senza monetizzarlo. Quando lo monetizzerò, sarò solo un’altra di quelle persone che vendono prodotti su internet per fare soldi.”

Sfide normative e mediche

La FDA ha confermato di non aver approvato “farmaci contenenti fenbendazolo per uso umano”, ha dichiarato Lauren-Jei McCarthy, addetta stampa della FDA, in una dichiarazione a The Epoch Times. Non è stato sottoposto ai rigorosi test e studi clinici richiesti per i farmaci destinati all’uso umano. Il fenbendazolo è approvato dalla FDA come farmaco antiparassitario per uso veterinario. È comunemente usato per sverminare cani, gatti, cavalli e bovini.

L’ivermectina, sebbene approvata dalla FDA per uso umano contro i vermi parassiti, non è approvata per il trattamento del cancro. Gli operatori sanitari possono prescrivere l’ivermectina per il cancro come farmaco riutilizzato. Entrambi i farmaci sono disponibili senza ricetta e vengono comunemente acquistati per uso veterinario.

Secondo Makis, gli effetti collaterali gravi di fenbendazolo e ivermectina sono rari.

“Ho osservato effetti collaterali moderati, tra cui spiacevoli sintomi visivi, vertigini e affaticamento”, ha affermato Makis.

Tippens è incoraggiato dalla ricerca in corso su altri farmaci approvati dalla FDA che potrebbero essere riutilizzati per il trattamento del cancro.

“A causa della mia storia clinica, credo che ci siano altre ricerche in corso nella categoria degli antiparassitari”, ha affermato Tippen. “Esistono sette farmaci simili al fenbendazolo. Un gruppo medico ha utilizzato il mebendazolo nel proprio protocollo. Credo di aver almeno aperto le persone a nuove possibilità.”

Rumiş Nanti Fenilalanina Potenziare Effetto Anti-Tumorale: Una Serie Di Casi

Ryan S Chiang^1*, Syed Ali B², Jonathan L Wright³, Bruce Montgomery³ di Sabbia e di Srinivas⁴

¹Dipartimento di Medicina di Stanford University Medical Center, Stanford, CA, Stati Uniti

²Dipartimento di Radiologia, Università di Stanford Medical Center, Stanford, CA, Stati Uniti

³Reparti di Urologia e Medicina, Università di Washington, Seattle, WA, Stati Uniti

⁴Divisione di Oncologia Medica, Dipartimento di Medicina, Università di Stanford MedicalCenter, Stanford, CA, Stati Uniti

*Autore Corrispondente:
Ryan Chiang
Dipartimento di Medicina
di Stanford University Medical Center di Stanford
410 Stazione Parco Cerchio Unità 107
a San Mateo, CA 94402, CA, USA
E-mail: sandrysri@stanford.edu

Ricevuto: 27 Ottobre 2020 Accettati: 15 Gennaio 2021 Pubblicato: 10 Febbraio 2021

Citazione:Chiang RS, Syed AB, Wright JL, Montgomery B, Srinivas S (2021) rumiş nanti fenilalanina Potenziare Effetto Anti-Tumorale: Una Serie di Casi. Clin Oncol Caso Rep 4:2

Abstract

Abstract

Sfondo: rumiş nanti fenilalanina (FBZ) è un buon mercato e facilmente disponibile, anti-parassitari, comunemente utilizzati in medicina veterinaria. FBZ appartiene alla benzimidazolo classe di droga che destabilizzano microtubuli attraverso un meccanismo simile a anti-oncogeni gli alcaloidi della vinca. Anche se non ci sono casi segnalati in letteratura, ci sono stati diversi aneddoti pubblicato sul sito web di blog con persone lodando la sua capacità di trattare un’ampia varietà di tumori.

Presentazioni di casi: in questo documento si descrivono i casi di tre pazienti con vari genito-urinario tumori maligni che hanno dimostrato risposta completa dopo la ricezione di FBZ terapia singola o complementare agente chemioterapico. In due pazienti scenari, avevano sperimentato la progressione della malattia metastatica, nonostante più linee di terapia, prima dell’inizio di FBZ. Effetti collaterali da FBZ sono stati segnalati.

Conclusione: FBZ sembra essere potenzialmente sicuro ed efficace agente antineoplastico che può essere riproposto per uso umano nel trattamento di neoplasie urogenitali. Sono necessarie ulteriori ricerche per definire il ruolo di FBZ come un chemioterapico opzione.

Parole chiave: rumiş nanti fenilalanina; Veterinari farmaco Anti-parassitari; Farmaco di rideterminazione; Immunoterapia; genito-urinario tumore maligno; carcinoma a cellule Renali; carcinoma Uroteliale

Introduzione

C’è stata una crescente popolarità negli ultimi anni, per l’uso di rumiş nanti fenilalanina (FBZ) come agente singolo o complementare terapeutico della chemioterapia per coloro che soffrono di varie forme di cancro. FBZ è un buon anti-elminti farmaco comunemente utilizzato nella pratica veterinaria e facilmente reperibile nei negozi di animali e disattivare i siti web commerciali. Tuttavia, nonostante i vari aneddoti e notizie presa di report per la sua efficacia nel trattamento del cancro metastatico, la letteratura clinica dietro utilizzando FBZ come un potenziale anti-neoplastica agente rimane inesistente. Esistente studi scientifici hanno principalmente studiato il suo meccanismo di azione attraverso l’uso di modelli animali [1–3]. Qui, descriviamo i tre casi in cui i pazienti ha raggiunto una risposta completa, tra cui due che hanno manifestato una progressione dopo più linee di terapia, quando FBZ è stato utilizzato da solo o in combinazione con le terapie standard.

Obiettivo e ambito dello studio

Questa revisione sistematica mirava a valutare il potenziale di riutilizzo dell’ivermectina come agente antitumorale , concentrandosi su:

La sicurezza clinica dell’ivermectina nei pazienti oncologici, basata su segnalazioni di casi e serie sul suo utilizzo nelle infezioni parassitarie
Attività antitumorale preclinica dell’ivermectina, basata su studi di laboratorio e su animali

Sono state identificate 2273 pubblicazioni, di cui 26 soddisfacevano i criteri di inclusione. Questi studi includevano 36 pazienti oncologici trattati con ivermectina orale , principalmente per infezioni parassitarie.

Sebbene nessuno dei casi clinici sia stato progettato per valutare gli effetti antitumorali, la revisione riassume anche un crescente corpus di prove precliniche a supporto dei potenziali meccanismi antitumorali dell’ivermectina.

Sicurezza nei pazienti oncologici

Tra i 36 pazienti oncologici, l’ivermectina è stata costantemente segnalata come ben tollerata.
Non sono stati attribuiti eventi avversi gravi all’ivermectina in nessuno dei pazienti affetti da cancro.
Gli effetti collaterali minori, quando presenti, erano aspecifici e si risolvevano spontaneamente (ad esempio, lievi disturbi gastrointestinali, eruzione cutanea transitoria).
L’ivermectina è stata somministrata in sicurezza ai pazienti con:
- Chemioterapia attiva
- Neoplasie ematologiche (ad esempio, leucemia, linfoma)
- Tumori solidi (ad esempio carcinoma mammario, carcinoma cervicale, carcinoma a cellule renali)

Osservazioni cliniche relative al cancro

Sebbene la revisione non abbia identificato studi formali che utilizzassero specificamente l’ivermectina come terapia contro il cancro in contesti clinici, alcuni casi clinici hanno evidenziato miglioramenti correlati al cancro:

LLA pediatrica (leucemia linfoblastica acuta)
- Un bambino di 6 anni affetto da leucemia linfoblastica acuta (LLA) è rimasto in buona salute ed è in remissione a lungo termine dopo il trattamento con ivermectina per un’infestazione da Demodex folliculorum .
- Non è stata osservata alcuna recidiva o progressione durante il follow-up.
Leucemia mieloide acuta (LMA)
- Un paziente sottoposto a chemioterapia ha sviluppato una scabbia disseminata.
- Dopo il trattamento orale con ivermectina (0,2 mg/kg, ripetuto dopo due settimane), tutte le papule rimanenti sono scomparse senza segni di recidiva.
- Il paziente è rimasto clinicamente stabile, anche se la remissione non è stata dichiarata esplicitamente.
Neoplasie ematologiche (leucemia, linfoma)
- Diversi pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali emopoietiche o sottoposti a trattamento per la leucemia sono stati trattati con ivermectina per infezioni da Demodex o altre infezioni parassitarie.
- In questi casi, i sintomi cutanei si sono risolti rapidamente e i pazienti sono rimasti stabili nel breve e medio termine, anche se non sono stati confermati effetti antitumorali diretti.
Leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATL)
- Un paziente con ATL e infezione da HTLV-1 è stato stabilizzato con successo e dimesso dopo una combinazione di ivermectina e chemioterapia.
- Gli autori osservano che l’ivermectina potrebbe aver contribuito al controllo della malattia, ma non è possibile trarre conclusioni definitive.

Meccanismi antitumorali (evidenze precliniche)

Studi preclinici su linee cellulari e modelli animali hanno dimostrato che l’ivermectina esercita effetti antitumorali attraverso molteplici meccanismi di soppressione tumorale, tra cui:

Inibizione della traslocazione nucleare di YAP1 (proteina 1 associata a Yes)
Soppressione del percorso di segnalazione Wnt/TCF (fattore delle cellule T)
Degradazione della chinasi 1 attivata da p21 (PAK1)
Inibizione della cascata di segnalazione AKT/mTOR
Induzione di disfunzione mitocondriale e stress ossidativo
Attivazione dell’apoptosi dipendente dalla caspasi

Questi meccanismi sono stati osservati in diversi tipi di cancro, in particolare:

Glioblastoma
cancro ovarico
Leucemia mieloide cronica (LMC)
cancro cervicale

La sicurezza dei vaccini contro l’epatite B somministrati ai neonati non è stata dimostrata in un singolo studio clinico randomizzato controllato con placebo, come indicato nei foglietti illustrativi, e contiene una dose eccessiva di alluminio neurotossico. Questo compendio di studi specialistici contiene prove sufficienti che i genitori possono presentare a medici e avvocati per impedire che i propri figli vengano avvelenati da vaccini privi di studi di sicurezza adeguati. Serve anche a istruire i medici acritici. Scarica il libro qui.

Secondo la più completa revisione sistematica ad oggi disponibile sull’uso dell’ivermectina nei pazienti oncologici, il farmaco sembra essere sicuro, anche nei pazienti sottoposti a chemioterapia attiva. Il suo ampio spettro di meccanismi antitumorali, dimostrato in modelli preclinici, insieme a segnalazioni aneddotiche di miglioramenti correlati al cancro, ne supportano la candidatura al riutilizzo come terapia oncologica. Sono necessari studi clinici su larga scala e ben progettati il prima possibile per valutare adeguatamente il potenziale dell’ivermectina contro il cancro.

Caso Di Presentazione

Caso 1

Un di 63 anni Caucasico maschio presenta con dolore al fianco, rapida perdita di peso e febbre transitoria.

Computerizzata addominale Topografia (CT) ha rivelato un 3 cm in basso a sinistra-polo tinta massa renale. Egli ha subito aperto nefrectomia parziale con patologia mostrando pT1a highgrade a cellule chiare, il Carcinoma a Cellule Renali (RCC).

Alcuni mesi più tardi, ha sviluppato un persistente dolore al fianco sinistro con la ricerca di un 5,2 cm al rene sinistro di massa. Aspirazione con Ago sottile (FNA) biopsia redemonstrated RCC a cellule chiare, e pazopanib 800 mg è stato avviato. Follow-up CT ha rivelato un nuovo 1.4 cm testa del pancreas/corpo lesione, persistente renale sinistra di massa, e i segni del sigma colite.

Date le preoccupazioni per la progressione della malattia e di intollerabili effetti collaterali, pazopanib è stato interrotto e cabozantinib è stato avviato. Intervallo di Imaging a Risonanza Magnetica (MRI) ha mostrato la dimensione stabile di ricorrenti renale sinistra di massa, lieve diminuzione del 2,9 cm testa del pancreas lesione, stabile 1.2 cm distali del corpo pancreatico lesione, e di 1.1 cm posteriore destra iliaca lesione ossea.

Cabozantinib in definitiva è stato interrotto a causa della persistente intollerabili effetti collaterali. Un mese dopo la sospensione, ripetere la RM ha mostrato un aumento delle dimensioni del ricorrente renale sinistra di massa, lieve diminuzione del 2,3 cm testa del pancreas lesione, stabile 1.4 cm distali del corpo pancreatico lesione, e invariata 1.1 cm posteriore destra iliaca lesione ossea.

Terza linea di trattamento con nivolumab è stato avviato, e ha ricevuto solo tre totale trattamenti (240 mg × 3) nel corso di un mese, a causa di rash gravi e colite. Egli è stato trattato con steroidi con risoluzione di colite. Durante questo tempo, ha anche iniziato una terapia alternativa con FBZ 1 gm tre volte la settimana, su suggerimento di uno dei suoi amici con la testa/collo. Intervallo di risonanza magnetica trovati vicino la risoluzione completa dei precedentemente osservato renale sinistra di massa, nonché di ridurre in testa del pancreas/corpo a destra e posteriore spina iliaca antero lesioni (Figura 1).

Serie di imaging per il passato 10 mesi non hanno mostrato alcuna evidenza di recidiva o di malattia metastatica. Ha continuato a prendere FBZ senza segnalati effetti collaterali.

Figura 1:la quasi completa risoluzione della persistente renale sinistra di massa (immagine a sinistra) dopo l’avvio di tre dosi totali di nivolumab e FBZ terapia 1 gm tre volte a settimana per diversi mesi (immagine di destra).

Caso 2

Una di 72 anni caucasico maschio presentato con l’aumento delle basse vie urinarie sintomi e una lesione uretrale. Ha subito distale penectomia con patologia mostrando pT2 alto grado di carcinoma uroteliale dell’uretra con focale differenziazione squamosa.

Quattro anni più tardi, il paziente ha sviluppato una tosse con l’individuazione di un 5.5 cm x 4.0 cm a sinistra ilare di massa e 1,5 cm x 1.4 cm lobo superiore sinistro nodulo, con più anormale AP finestra linfonodi, la più grande misura 1.8 cm x 0,9 cm tutti avid su PET-TC. MRI del cervello che ha rivelato un destro lobo occipitale metastasi. Broncoscopia con biopsia ha rivelato di carcinoma squamoso.

La sua presentazione è ritenuto più coerente con un polmone primaria e la paziente è stata trattata con gamma knife radioterapia e carboplatino, paclitaxel, e pembrolizumab. Il successivo sequenziamento della lesione da penectomia e la broncoscopia dimostrato condiviso PIK3CA, RB1, CCND1 e CDKN2A alterazioni dimostrando che la malattia polmonare rappresentato metastasi da uretrale primaria. Il paziente ha sviluppato progressiva malattia retroperitoneale mentre pembrolizumab di manutenzione ed è stato trattato con gemcitabina e cisplatino per 6 cicli nel corso di 4 mesi, con risposta completa.

Tuttavia, l’intervallo di CT imaging hanno dimostrato di aumentare di un aortocaval nodo da 1,2 cm x 1.0 cm a 1.5 cm x 1.5 cm. Nessuna terapia è stata avviata un’analisi successiva ha dimostrato di aumentare ulteriormente la 2.0 cm x 1,5 cm con nessuna evidenza di progressione altrove (Figura 2).

Il paziente ha optato per la terapia complementare con FBZ 1 grammo per via orale tre giorni a settimana, vitamina E 800 mg al giorno, la curcumina è di 600 mg al giorno e CBD olio in attesa di maggiori sostanziale progressione della malattia prima di iniziare una terapia sistemica addizionale. Di serie CTs dal passato 9 mesi ha mostrato progressiva riduzione delle dimensioni di 0,5 cm x 0,5 cm, completo radiografici risposta.

Figura 2: completa radiografici risposta di un 2.0 cm x 1,5 cm aortocaval nodo (immagine a sinistra) dopo l’inizio della terapia alternativa tra FBZ terapia 1 gm tre volte a settimana (immagine di destra).

Caso 3

Una di 63 anni femmina caucasica ha presentato con l’aumento delle basse vie urinarie, sintomi ed ematuria. L’imaging TC ha rivelato una massa laterale destra della vescica di 7,5 cm con estensione del diritto parete laterale del bacino e di destra-parteggiato idronefrosi posto per nefrostomia percutanea. Non c’era nessuna evidenza di malattia metastatica, coerente con la clinica tumore T4.

La Resezione transuretrale della vescica Tumore (TURBT) ha dimostrato una grande massa necrotica con patologia conferma di carcinoma uroteliale con l’85% squamose e il 2% istologia sarcomatoide. Lei è stata trattata con Accelerato il Metotrexato, Vinblastina, Doxorubicina e Cisplatino (AMVAC) per 6 cicli nel corso di 4 mesi, insieme con concomitante FBZ 1 grammo di tre volte alla settimana.

La TC di follow-up ha rivelato alcuna evidenza di malattia minima residua ispessimento inferiore destro della parete vescicale ( Figura 3 ). Ha rifiutato di procedere con la cistectomia e rimane su di sorveglianza con nessuna evidenza di progressione.

Figura 3: Risoluzione da 7,5 cm laterale destra della vescica massa (immagine a sinistra) dopo il trattamento con TURBT, Accelerato il Metotrexato, Vinblastina, Doxorubicina e Cisplatino (AMVAC), e la contestuale FBZ 1 gm tre volte a settimana (immagine di destra).

Discussione

In sintesi, ci sono tre pazienti con diverse primaria genito-urinario tumori che hanno dimostrato risposta completa dopo la ricezione di FBZ terapia. Questo solleva la questione di come efficace FBZ può essere come un anti-oncogeni agente e merita ulteriori indagini. A nostra conoscenza, non c’è stata una simile serie di casi segnalati.

FBZ appartiene a una classe di microtubule-agenti destabilizzanti conosciuti collettivamente come il benzimidazoli. La capacità di disturbare la polimerizzazione dei microtubuli per indurre arresto mitotico e promuovere l’apoptosi è una caratteristica condivisa con alcaloidi della vinca. Meccanismi proposti per FBZ anti-tumorale proprietà includono l’inibizione di proteosomale attività, attivazione di p53, la citotossicità via tubulina interruzione, e downregulation di enzimi glicolitici, cruciale per la sopravvivenza delle cellule di cancro [1,4]. Altre benzimidazoli come albendazole possiedono proprietà antitumorali attraverso influenzando l’HIF-1 alfa percorso che è fondamentale per l’espressione di VEGF e di alcuni aspetti della glicolisi [5]. La varietà dei meccanismi con cui questa classe di farmaci funzioni può aiutare a limitare la propagazione di resistente linee di cellule di cancro attraverso il targeting di molteplici vie di sopravvivenza delle cellule di cancro.

FBZ sicuro è stato utilizzato come un anti-parassitari per diverse specie animali e potrebbe essere riproposto per il trattamento di neoplasie umane. Diversi benzimidazoli hanno già mostrato la promessa umana riuso. Un esempio è parbendazole, che ha dimostrato la potenziale efficacia come terapia complementare alla gemcitabina in pazienti con cancro del pancreas [6]. Mebendazole è stato dimostrato che in caso di rapporti efficaci con pochi effetti collaterali in pazienti con metastasi di carcinoma corticosurrenale e cancro del colon metastatico [7,8]. Mebendazole e flubendazole hanno anche dimostrato di essere efficace in studi su animali per il glioblastoma multiforme e neoplasie ematologiche, rispettivamente [9,10]. Dato prova di elevata tollerabilità e l’applicabilità di una vasta gamma di tumori maligni, questo garantisce ulteriore indagine per FBZ e altri benzimidazoli sicuro opzioni chemioterapici.

Studi precedenti hanno dimostrato che il cancro risposta immunitaria checkpoint inibitori come nivolumab come una terza linea di agente in mRCC [11]. La durata della terapia è spesso molto più bisogno di un mediano di terapia della durata di 6 mesi, con il 24% tasso di risposta globale in terza linea di trattamento. È possibile che il nostro primo paziente con mRCC avrebbe ottenuto una risposta significativa a nivolumab da solo senza FBZ. Tuttavia, data la completa radiologici di risposta di solo 1 mese di checkpoint immunitario terapia con inibitori, sembra anche probabile che FBZ giocato un ruolo importante nell’induzione della remissione. Questo è supportato dal fatto che il nostro paziente è rimasto in remissione prolungato mentre solo FBZ per quasi un anno senza ulteriori amministrazione del checkpoint immunitario terapia con inibitori.

Conclusione

Non ci resta limitata di dati con pochi studi pubblicati sull’anti-oncogeni proprietà di FBZ. Altre benzimidazoli sono stati studiati per una misura più grande, e la conoscenza possono essere utilizzati come guida per il futuro FBZ studi al fine di valutare l’efficacia di questa classe di farmaci sia come un solitario agente o in terapia di combinazione. Considerati i potenziali vantaggi di FBZ con quello che sembra essere un limitato profilo di tossicità, ulteriori ricerche sono necessarie per valutare le situazioni cliniche in cui questo farmaco può essere utile e riproposto per i pazienti con progressiva genito-urinario tumore maligno e possibilmente in altri maligni impostazioni.

Riferimenti

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Gao P, Dang CV, Watson J (2008)Imprevisti antitumorigenic effetto di rumiş nanti fenilalanina quando combinato con vitamine supplementari.J Am Assoc Laboratorio Anim Sci 47: 37-40.
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Dogra N, Mukhopadhyay T (2012)Compromissione del sistema ubiquitina-proteasoma da metil N-(6-phenylsulfanyl-1H-benzimidazol-2-yl) carbammato porta a un potente effetto citotossico in cellule tumorali: Un nuovo agente antiproliferativo con un potenziale implicazione terapeutica.J Biol Chem 287: 30625-30640.
Zhou F, Du J, Wang J (2017)Albendazole inibisce HIF-1α-dipendente glicolisi e l’espressione di VEGF nel polmone non a piccole cellule in cellule di cancro.Mol Cell Biochem 428: 171-178.
Florio R, Veschi S, di Giacomo V, Pagotto S, Carradori S, et al (2019)Il benzimidazolo a base di antielmintico parbendazole: Una riproposto candidato farmaco che superando con gemcitabina nel carcinoma pancreatico.Tumori (Basilea) 11: 2042.
Dobrosotskaya IY, Martello GD, Schteingart DE, Maturen KE, Worden FP (2011)Mebendazole in monoterapia e lungo termine per il controllo delle malattie in metastasi di carcinoma corticosurrenale.Endocr Prat 17: e59-e62.
Nygren P, Larsson R (2014)Interazioni riposizionamento dalla panchina al capezzale: remissione del Tumore dal antihelmintic farmaco mebendazole in refrattario cancro del colon metastatico.Acta Oncol 53: 427-428.
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Altre note

Altre Note relative

Secondo l’autorevole quotidiano di New York l’ivermectina combatte in
maniera efficace il virus 21, tra cui anche il SARS-CoV-2 riuscendone a
ridurre la carica virale nelle cellule del 99,8% in 24 ore e de 99,98% in due
giorni. Numeri strabilianti che consiglierebbero l’utilizzo immediato del
farmaco che però, nella fase di emergenza sanitaria, non è stato preso in
considerazione dal governo americano. Dei 115 pazienti trattati con la
medicina, inoltre, nessuno ha contratto polmoniti o
vantaggi vantaggiosi, il numero di pazienti ricoverati in
terapia intensiva è ai minimi (solo lo 0,1%) e il processo di negativizzazione è
stato molto veloce: quattro giorni invece di 15. La mortalità, secondo lo studio
presentato dal WSJ, è solo del 13,3% contro il 24,5% dei pazienti non trattati
col farmaco farmacologico.

IVERMECTINA, UN FARMACO CHE PREVIENE IL VIRUS
Secondo uno studio citato dal quotidiano americano, un articolo del 2020 del
Biochemical and Biophysical Research Communications, il farmaco previene
l’infezione da Covid-19. Tutti i familiari di persone positive al virus che lo
hanno avuto somministrato, infatti, sono rimasti immuni, solo l’8% ha
contratto il coronavirus. Inoltre il farmaco sarebbe del tutto sicuro, in quanto
dal 1998 ad oggi sono stati rilevati solo 28 casi di gravi effetti neurologici. A
non far quadrare i conti è poi l’utilizzo incondizionato della medicina in casi
di gravidanza, ma anche la somministrazione possibile a bambini e neonati.

Perché l’attacco? E’ la domanda alla quale vorrebbe rispondere il quotidiano
che però, dopo l’analisi attenta dei dati, continua a puntare il dito contro la
Food and Drug Administration. A dir la verità, uscendo dal territorio
americano, anche l’Agenzia Europea del farmaco boccia l’utilizzo
dell’ivermectina. Sul sito dell’EMA si legge: “L’EMA ha esaminato le ultime
evidenze sull’uso di ivermectina per la prevenzione e il trattamento di COVID19 e ha concluso che i dati disponibili non ne sostengono l’uso al di fuori di
studi clinici ben progettati. Nell’UE l’uso dei medicinali a base di questo
principio attivo non è autorizzato per COVID-19 e l’EMA non ha ricevuto
alcuna domanda per autorizzare tale uso”.

,,,,

Punti salienti

•
L’ivermectina è un inibitore del virus causativo del COVID-19 (SARS-CoV-2) in vitro.
•
Un singolo trattamento in grado di ridurre di circa 5000 volte il virus dopo 48 ore dalla coltura cellulare.
•
L’ivermectina è approvata dalla FDA per le infezioni parassitarie e pertanto può essere riutilizzata.
•
L’ivermectina è ampiamente disponibile, grazie alla sua inclusione nell’elenco dei medicinali essenziali dell’OMS.

Astratto

Sebbene siano attualmente in corso diversi studi clinici per testare possibili terapie, la risposta mondiale all’epidemia di COVID-19 è stata in gran parte limitata al monitoraggio/contenimento. Segnaliamo qui che l’ivermectina , un antiparassitario approvato dalla FDA che in precedenza ha dimostrato di avere attività antivirale ad ampio spettro , è un inibitore del virus causale (SARS-CoV-2), con una singola aggiunta alle cellule Vero-hSLAM 2 ore dopo l’infezione da SARS-CoV-2 in grado di ottenere una riduzione di circa 5000 volte dell’RNA virale a 48 ore. L’ivermectina merita pertanto ulteriori studi per possibili benefici nell’uomo. in vitro

1. Introduzione

L’ivermectina è un agente antiparassitario ad ampio spettro approvato dalla FDA ( Gonzalez Canga et al., 2008 ) che negli ultimi anni noi, insieme ad altri gruppi, abbiamo dimostrato avere attività antivirale contro un’ampia gamma di virus ( Gotz et al., 2016 ; Lundberg et al., 2013 ; Tay et al., 2013 ; Wagstaff et al., 2012 ) in vitro .

Originariamente identificata come un inibitore dell’interazione tra la proteina integrasi (IN) del virus dell’immunodeficienza umana-1 (HIV-1) e l’ eterodimero α/β1 dell’importina (IMP) responsabile dell’importazione nucleare di IN ( Wagstaff et al., 2011 ), è stato successivamente confermato che l’ivermectina inibisce l’importazione nucleare di IN e la replicazione dell’HIV-1 ( Wagstaff et al., 2012 ). Sono state segnalate altre azioni dell’ivermectina ( Mastrangelo et al., 2012 ), ma è stato dimostrato che l’ivermectina inibisce l’importazione nucleare dell’ospite (ad es. ( Kosyna et al., 2015 ; van der Watt et al., 2016 )) e delle proteine virali , tra cui l’antigene tumorale di grandi dimensioni (T-ag) del virus delle scimmie SV40 e la proteina non strutturale 5 del virus della dengue (DENV) ( Wagstaff et al., 2012 , Wagstaff et al., 2011 ).

È importante sottolineare che è stato dimostrato che limita l’infezione da virus a RNA come DENV 1-4 ( Tay et al., 2013 ), virus del Nilo occidentale ( Yang et al., 2020 ), virus dell’encefalite equina venezuelana (VEEV) ( Lundberg et al., 2013 ) e influenza ( Gotz et al., 2016 ), con questa attività ad ampio spettro che si ritiene sia dovuta alla dipendenza di molti diversi virus a RNA da IMPα/β1 durante l’infezione ( Caly et al., 2012 ; Jans et al., 2019 ). Allo stesso modo, è stato dimostrato che l’ivermectina è efficace contro il virus della pseudorabbia (PRV) a DNA sia in vitro che in vivo , con il trattamento con ivermectina che ha dimostrato di aumentare la sopravvivenza nei topi infetti da PRV ( Lv et al., 2018 ).

Non è stata osservata efficacia dell’ivermectina contro il virus Zika (ZIKV) nei topi, ma gli autori hanno riconosciuto che i limiti dello studio giustificavano una rivalutazione dell’attività anti-ZIKV dell’ivermectina ( Ketkar et al., 2019 ). Infine, l’ivermectina è stata oggetto di uno studio clinico di fase III.in Thailandia nel 2014-2017, contro l’infezione da DENV,

in cui una singola dose orale giornaliera si è dimostrata sicura e ha portato a una significativa riduzione dei livelli sierici della proteina virale NS1 , ma non è stato osservato alcun cambiamento nella viremia o beneficio clinico (vedi sotto) ( Yamasmith et al., 2018 ).

L’agente eziologico dell’attuale pandemia di COVID-19, SARS-CoV-2, è un virus a RNA a singolo filamento a senso positivo strettamente correlato al coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV).

Studi sulle proteine SARS-CoV hanno rivelato un potenziale ruolo di IMPα/β1 durante l’infezione nella chiusura nucleocitoplasmatica segnale-dipendente della proteina nucleocapside SARS-CoV ( Rowland et al., 2005 ; Timani et al., 2005 ; Wulan et al., 2015 ), che può influire sulla divisione cellulare dell’ospite ( Hiscox et al., 2001 ; Wurm et al., 2001 ). Inoltre, è stato dimostrato che la proteina accessoria del SARS-CoV ORF6 antagonizza l’attività antivirale del fattore di trascrizione STAT1 sequestrando IMPα/β1 sulla membrana ruvida del reticolo endoplasmatico (RE) e dell’apparato di Golgi ( Frieman et al., 2007 ). Nel complesso, questi studi suggeriscono che l’attività inibitoria del trasporto nucleare dell’ivermectina possa essere efficace contro il SARS-CoV-2.

Per testare l’attività antivirale dell’ivermectina verso SARS-CoV-2, abbiamo infettato cellule Vero/hSLAM con l’isolato di SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020 a una MOI di 0,1 per 2 ore, seguita dall’aggiunta di 5 μM di ivermectina. Il supernatante e i pellet cellulari sono stati raccolti nei giorni 0-3 e analizzati mediante RT-PCR per la replicazione dell’RNA di SARS-CoV-2 ( Fig. 1 A/B). A 24 ore, si è osservata una riduzione del 93% dell’RNA virale presente nel supernatante (indicativo di virioni rilasciati) dei campioni trattati con ivermectina rispetto al veicolo DMSO . Analogamente, è stata osservata una riduzione del 99,8% dell’RNA virale associato alle cellule (indicativo di virioni non rilasciati e non impacchettati) con il trattamento con ivermectina. Entro 48 ore questo effetto è aumentato fino a una riduzione di circa 5000 volte dell’RNA virale nei campioni trattati con ivermectina rispetto ai campioni di controllo, indicando che il trattamento con ivermectina ha portato alla perdita effettiva di essenzialmente tutto il materiale virale entro 48 ore. In linea con questa idea, non è stata osservata alcuna ulteriore riduzione dell’RNA virale a 72 ore. Come abbiamo osservato in precedenza ( Lundberg et al., 2013 ; Tay et al., 2013 ; Wagstaff et al., 2012 ), non è stata osservata alcuna tossicità dell’ivermectina in nessuno dei punti temporali testati, né nei pozzetti dei campioni né nei campioni del solo farmaco testati in parallelo.

Fig. 1. L’ ivermectina è un potente inibitore dell’isolato clinico SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020. Le cellule Vero/hSLAM sono state infettate con l’isolato clinico SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020 (MOI = 0,1) per 2 ore prima dell’aggiunta del veicolo (DMSO) o dell’ivermectina alle concentrazioni indicate. I campioni sono stati prelevati 0–3 giorni dopo l’infezione per la quantificazione della carica virale mediante PCR in tempo reale del virus associato alle cellule ( A ) o del supernatante ( B ).

I valori di IC50 _sono stati determinati in esperimenti successivi a 48 ore dall’infezione utilizzando le concentrazioni indicate di ivermectina (trattata 2 ore dopo l’infezione come da A/B ). Analisi PCR in tempo reale triplicata è stata eseguita sul virus associato alle cellule ( C/E ) o sul supernatante ( D/F ) utilizzando sonde contro i geni SARS-CoV-2 E ( C/D ) o RdRp ( E/F ). I risultati rappresentano media ± DS (n = 3). Curve dose-risposta a 3 parametri sono state adattate utilizzando il prisma GraphPad per determinare i valori IC ₅₀ (indicati). G. Schema dell’azione antivirale proposta dell’ivermectina sul coronavirus . IMPα/β1 si lega alla proteina cargo del coronavirus nel citoplasma (in alto) e la trasloca attraverso il complesso del poro nucleare (NPC) nel nucleo dove il complesso si disgrega e il carico virale può ridurre la risposta antivirale della cellula ospite, portando a un’infezione più grave.

L’ivermectina si lega e destabilizza l’ eterodimero Impα/β1 , impedendo così a Impα/β1 di legarsi alla proteina virale (in basso) e impedendole di entrare nel nucleo.

Ciò probabilmente determina una ridotta inibizione delle risposte antivirali, dando origine a una risposta antivirale normale e più efficiente.

Per determinare ulteriormente l’efficacia dell’ivemectina, le cellule infette da SARS-CoV-2 sono state trattate con diluizioni seriali di ivermectina 2 ore dopo l’infezione e il surnatante e i pellet cellulari sono stati raccolti per RT-PCR in tempo reale a 48 ore ( Fig. 1 C/D). Come sopra, è stata osservata una riduzione >5000 dell’RNA virale sia nel surnatante che nei pellet cellulari da campioni trattati con 5 μM di ivermectina a 48 ore, equivalente a una riduzione del 99,98% dell’RNA virale in questi campioni.

Anche in questo caso, non è stata osservata alcuna tossicità con ivermectina a nessuna delle concentrazioni testate. La IC50 del trattamento con ivermectina è stata determinata essere ~2 μM in queste condizioni. Sottolineando il fatto che il test ha effettivamente rilevato specificamente SARS-CoV-2, gli esperimenti RT-PCR sono stati ripetuti utilizzando primer specifici per il gene virale RdRp ( Fig. 1 E/F) anziché per il gene E (sopra), con risultati quasi identici osservati sia per il virus rilasciato (surnatante) che per quello associato alle cellule.

Presi insieme, questi risultati dimostrano che l’ivermectina ha un’azione antivirale contro l’isolato clinico di SARS-CoV-2 in vitro ,

con una singola dose in grado di controllare la replicazione virale entro 24-48 ore nel nostro sistema. Ipotizziamo che ciò avvenga probabilmente attraverso l’inibizione dell’importazione nucleare di proteine virali mediata da IMPα/β1 ( Fig. 1 G), come mostrato per altri virus a RNA ( Tay et al., 2013 ;

Wagstaff et al., 2012 ; Yang et al., 2020 ); la conferma di questo meccanismo nel caso di SARS-CoV-2 e l’identificazione dello specifico SARS-CoV-2 e/o dei componenti dell’ospite interessati (vedi ( Yang et al., 2020 )) è un importante obiettivo del lavoro futuro in questo laboratorio.

In definitiva, lo sviluppo di un antivirale efficace per SARS-CoV-2, se somministrato ai pazienti nelle fasi iniziali dell’infezione, potrebbe contribuire a limitare la carica virale, prevenire la progressione grave della malattia e limitare la trasmissione interumana.

Sarebbe quindi importante effettuare test di benchmarking dell’ivermectina rispetto ad altri potenziali antivirali per SARS-CoV-2 con meccanismi d’azione alternativi ( Dong et al., 2020 ; Elfiky, 2020 ; Gordon et al., 2020 ; Li e De Clercq, 2020 ; Wang et al., 2020 ) il prima possibile. Questo breve rapporto solleva la possibilità che l’ivermectina possa essere un utile antivirale per limitare il SARS-CoV-2, in modo simile a quelli già segnalati ( Dong et al., 2020 ; Elfiky, 2020 ; Gordon et al., 2020 ; Li e De Clercq, 2020 ; Wang et al., 2020 ); finché uno di questi non si dimostrerà efficace in ambito clinico, tutti dovrebbero essere perseguiti il più rapidamente possibile.

L’ivermectina ha un profilo di sicurezza consolidato per l’uso umano ( Gonzalez Canga et al., 2008 ; Jans et al., 2019 ; Buonfrate et al., 2019 ) ed è approvata dalla FDA per diverse infezioni parassitarie ( Gonzalez Canga et al., 2008 ; Buonfrate et al., 2019 ).

È importante sottolineare che recenti revisioni e metanalisi indicano che l’ivermectina ad alto dosaggio ha una sicurezza comparabile al trattamento standard a basso dosaggio, sebbene non vi siano prove sufficienti per trarre conclusioni sul profilo di sicurezza in gravidanza ( Navarro et al., 2020 ; Nicolas et al., 2020 ).

Il prossimo passo fondamentale nell’ulteriore valutazione del possibile beneficio nei pazienti COVID-19 sarà quello di esaminare un regime di dosaggio aggiuntivo multiplo che imiti l’attuale utilizzo approvato dell’ivermectina negli esseri umani.

Come accennato, l’ivermectina è stata al centro di un recente studio clinico di fase III su pazienti affetti da dengue in Thailandia, in cui una singola dose giornaliera si è dimostrata sicura ma non ha prodotto alcun beneficio clinico. Tuttavia, i ricercatori hanno osservato che potrebbe essere sviluppato un regime posologico migliorato, sulla base di dati farmacocinetici ( Yamasmith et al., 2018 ).

Sebbene il DENV sia chiaramente molto diverso dal SARS-CoV-2, questo disegno di studio dovrebbe ispirare i lavori futuri. Nel complesso, il rapporto attuale, combinato con un profilo di sicurezza noto, dimostra che l’ivermectina merita ulteriore considerazione come possibile antivirale per il SARS-CoV-2.

2. Metodi

2.1 Colture cellulari, infezioni virali e trattamento farmacologico

Le cellule Vero/hSLAM ( Ono et al., 2001 ) sono state mantenute in Earle’s Minimum Essential Medium (EMEM) contenente il 7% di siero bovino fetale (FBS) (Bovogen Biologicals, Keilor East, AUS), 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio , 1500 mg/L di bicarbonato di sodio , 15 mM di HEPES e 0,4 mg/ml di genetica a 37 °C, 5% di CO2 _. Le cellule sono state seminate in piastre per coltura tissutale a 12 pozzetti 24 ore prima dell’infezione con SARS-CoV-2 (isolato Australia/VIC01/2020) a una MOI di 0,1 nel terreno di infezione (come per il terreno di mantenimento ma contenente solo il 2% di FBS) per 2 ore.

Il terreno contenente l’inoculo è stato rimosso e sostituito con 1 mL di terreno fresco (2% FBS) contenente Ivermectina alle concentrazioni indicate o solo DMSO e incubato come indicato per 0-3 giorni. Al momento opportuno, il surnatante cellulare è stato raccolto e centrifugato per 10 minuti a 6.000 g per rimuovere i detriti, quindi trasferito in provette di raccolta fresche.

I monostrati cellulari sono stati raccolti mediante raschiamento e risospensione in 1 mL di terreno fresco (2% FBS). I controlli di tossicità sono stati allestiti in parallelo in ogni esperimento su cellule non infette.

2.2 Generazione del cDNA del SARS-CoV- 2

L’RNA è stato estratto da aliquote di 200 μL di campione di surnatante o sospensione cellulare utilizzando il kit QIAamp 96 Virus QIAcube HT (Qiagen, Hilden, Germania) ed eluito in 60 μL. La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando il kit BioLine SensiFAST cDNA (Bioline, Londra, Regno Unito), miscela di reazione totale (20 μL), contenente 10 μL di estratto di RNA, 4 μL di tampone TransAmp 5x, 1 μL di trascrittasi inversa e 5 μL di acqua priva di nucleasi . Le reazioni sono state incubate a 25 °C per 10 minuti, 42 °C per 15 minuti e 85 °C per 5 minuti.

2.3 . Rilevamento del SARS-CoV-2 mediante un test TaqMan Real-time RT-PCR

Il test TaqMan RT-PCR è stato eseguito utilizzando 2,5 μl di cDNA, 10 μl di Primer Design PrecisonPLUS qPCR Master Mix 1 μM Forward (5′- AAA TTC TAT GGT GGT TGG CAC AAC ATG TT-3′), 1 μM Reverse (5′- TAG GCA TAG CTC TRT CAC AYT T-3′) primer e 0,2 μM sonda (5′-FAM- TGG GTT GGG ATT ATC-MGBNFQ-3′) mirata al gene BetaCoV RdRp (RNA polimerasi RNA-dipendente) o Forward (5′-ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT -3′), 1 μM Reverse (5′-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A-3′) primer e 0,2 μM sonda (5′-FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-286 NFQ-3′) che ha come target il gene E del BetaCoV ( Corman et al., 2020 ). I test di RT-PCR in tempo reale sono stati eseguiti su una macchina per PCR in tempo reale Applied Biosystems ABI 7500 Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizzando condizioni di ciclo di 95 °C per 2 min, 95 °C per 5 s, 60 °C per 24 s. Il cDNA di SARS-CoV-2 (Ct~28) è stato utilizzato come controllo positivo. I valori Ct calcolati sono stati convertiti in riduzione di piega dei campioni trattati rispetto al controllo utilizzando il metodo ΔCt (piega modificata nell’RNA virale = 2^ΔCt) ed espressi come % del campione di solo DMSO . I valori IC50 sono stati adattati utilizzando curve di risposta alla dose a 3 parametri nel prisma GraphPad.

Finanziamento

Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio della National Breast Cancer Foundation, Australia ( ECF-17-007 ) per KMW e da una borsa di studio della National Health and Medical Research Council ( NHMRC), Australia Senior Principle Research Fellow (SPRF) ( APP1103050 ) per DAJ.

Riferimenti

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D. Buonfrate , et al.
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Caly e altri, 2012
L. Caly , KM Wagstaff , DA Jans
Traffico nucleare di proteine dai virus a RNA: potenziale bersaglio per gli antivirali?
Antivir. Ris. , 95 ( 2012 ) , pp. 202 – 206